2023年11月，日本厚生劳动省批准了CSL与Arcturus therapeutics联合开发的自复制RNA(saRNA)新冠疫苗：ARCT-154（一款saRNA-LNP冻干制剂），成为全球首款上市的saRNA传染病疫苗。为了解saRNA疫苗的序列设计、LNP脂质组分、LNP包封工艺、以及saRNA-LNP冻干工艺，菌菌汇总了近年来Arcturus Therapeutics申请的saRNA相关专利（WO2021183563, WO2020191103, WO2022056413, WO2022036170），以供参考。

saRNA 疫苗的序列设计专利

saRNA和常规mRNA都属于体外转录（IVT）合成的RNA，也称为IVT RNA。在序列组成方面，saRNA有以下序列特征：①saRNA包含常规mRNA序列组成元件：5’ UTR、蛋白编码区（CDS）、3’ UTR和poly(A)尾；②saRNA的序列特征在于：除目标蛋白编码区域外，saRNA还额外涵盖一个编码区域，即位于5’ UTR下游的alpha病毒（甲病毒）等来源的非结构蛋白（nsp）基因序列，以在细胞内表达RNA复制酶；以及目标蛋白编码序列上游的亚基因组启动子序列（SGP）。

Arcturus Therapeutics在WO2021183563中公开了saRNA设计平台STARR的所有序列，即5’ UTR、病毒来源的非结构蛋白（nsp 1-4）、SGP、CDS（GOI）、3’ UTR和poly(A)尾；专利同时介绍了ARTC-021的小鼠免疫原性，也提及了LNP的包封和冻干技术（注：ARTC-021是ARCT-154的上一代产品，编码原始新冠毒株来源的S蛋白）。经序列比对，STARR平台的5’UTR来源于α病毒委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV），非结构蛋白（nsp 1-4）来源为α病毒委内瑞拉马脑炎病毒（VEEV）。

菌菌在前期文章中对ARCT-154的序列进行了详细的解析，感兴趣可

SaRNA的序列设计平台STARR（WO2021183563）

不同长度RNA的LNP包封专利

Arcturus Therapeutics在专利WO2020191103中公开了使用脂质包封不同长度RNA的流程，测试了脂质纳米颗粒（LNP）的包封率、粒径和多分散系数（PDI）。

RNA-LNP的脂质组分：阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG脂质（PEG-DMG）的比例为48-60 : 5-10 : 28-38 : 0.5-3.0。

专利WO2020061426A2

RNA-LNP的包封流程：将RNA换液至乙酸溶液中，得到水相；4种脂质按照一定比例混合溶解在乙醇中，得到乙醇相。含RNA的水相溶液通过KNAUER高精度低脉冲泵进入水相入口；含脂质的乙醇相由泵进入脂质入口，流速范围在25~87.5 mL/min。RNA的流速为脂质流速的3倍，流出液为25%的乙醇溶液。随后将流出液在缓冲液中稀释，切向流过滤去除游离RNA和乙醇。

SaRNA-LNP的包封流程（WO2020191103）

这项专利没有专注于saRNA的包封，而是测试了不同长度的线性RNA。但开发人员实例列举了如何使用LNP包封长度约12000 nt（saRNA常规长度）的线性RNA。在该专利中，长度800 nt至12,000 nt的线性RNA的包封率均达到95%以上，粒径也在100 nm以下。但对于多分散系数（PDI）这一质量属性，12000 nt的长链RNA的粒径分布较差（PDI=0.2）。为此，Arcturus Therapeutics又在下述专利中对LNP包封工艺进行了优化。

不同长度RNA-LNP的包封效果（WO2020191103）

saRNA的LNP包封专利

在专利WO2022056413中，Arcturus Therapeutics公开了适合更长的saRNA的包封工艺，关键点在于降低混合流速和剪切力。具体方法为：

SaRNA-LNP脂质组分和比例：阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG脂质（PEG-DMG）的比例为50:10:38.5:1.5。

RNA-LNP的包封流程：总脂质:RNA的质量比约为35.78:1，乙醇相和水相流速分别控制在30~75、90~225 mL/min。结果显示，包封率方面，相比120-200 ml/min，333 ml/min总流速下的包封率明显降低；粒径和PDI的大致趋势为，随着流速的降低，saRNA-LNP的粒径明显增加，PDI系数也增大。过高的流速对saRNA-LNP的质量不利。

不同流速对saRNA-LNP包封效果的影响（WO2022056413）

saRNA-LNP的冻干工艺专利

冻干是解决saRNA-LNP保存和运输的有效方案，首款上市的ARCT-154也是冻干粉剂型。Arcturus Therapeutics在专利WO2022036170中介绍了saRNA-LNP制剂的冻干工艺。开发人员通过比较LNP冻干制剂与冻干前、常规冷冻/解冻循环（即在-70°C冷冻在室温下解冻）后的LNP制剂，科学性地分析了LNP冻干制剂的质量。

冻干工艺简述如下：

将saRNA-LNP换液至目标缓冲液中：0.01~0.05M山梨酸钾、0.01 ~ 0.10% w/v 泊洛沙姆 188、14~18% w/v蔗糖，25~75 mM NaCl、15 ~ 25 mM pH 8.0 Tris缓冲液。随后至冻干设备中进行冻干。冻干后saRNA-LNP制剂粒径、PDI达到质量要求。冻干前样品saRNA包封率为97%，PDI为0.129；冻干后样品saRNA包封率为93%，PDI为0.152。SaRNA-LNP的冻干参数如下：

SaRNA-LNP的冻干工艺（WO2022036170）

总结

Arcturus Therapeutics关于saRNA疫苗的专利发布较为活跃，涵盖了序列、LNP包封、LNP制剂冻干工艺，并由此与Moderna、BioNTech、CureVac等常规mRNA研发企业拉开了差异。

国内外其他布局saRNA的企业包括GSK、Gritstone、VaxEquity、Replicate Bioscience、嘉晨西海等，其技术开发和管线进展也值得我们期待。

参考文献

[1] Perenkov AD, Sergeeva AD, Vedunova MV, Krysko DV. In Vitro Transcribed RNA-Based Platform Vaccines: Past, Present, and Future. Vaccines (Basel). 2023 Oct 16;11(10):1600. doi: 10.3390/vaccines11101600.

[2] Brice Sagot. What IP is behind the self-amplifying mRNA vaccine platform developed by Arcturus Therapeutics? KnowMade. 2023. Jan 4.