荧光光谱应用简介

本节旨在通过提供对这一自然现象背后的基本物理学的理解来介绍荧光。无论您是该领域的新手，还是已经使用荧光多年，本节都是对您工作背后的科学的一个很好的概述。

波长应用

图1：电磁波谱的可视化，使用波长量化，可见光区突出显示

电磁波谱的任何部分都由包含它的光的波长定性地定义。换句话说，光波的波长几乎告诉了我们想知道的一切。在荧光显微镜中，纳米（nm）是最常用的单位，并且通常被报道为人类可感知的光谱部分的范围为约380nm至710nm。虽然个人的主观性使其难以量化，但只有约15%的人类可以看到680nm以上的任何东西，并且由于眼睛损伤的风险，不建议观看420nm以下的光线。可见光谱可以分解为特定的波长范围，每个波长范围对应于我们所说的颜色：

紫色和靛蓝色：380-450 nm

蓝色和浅绿色：450-500 nm

绿色：500-570纳米

黄色和橙色：570-610 nm

红色：610-710 nm

直接位于可见光谱侧面的波长对于荧光世界也是有用的。它们由从320到400nm（近UV）的短波长带和从750到大约2500nm（近IR）的长波长带组成。

在光学中，通常选择波长而不是频率来量化光，但它们都是成比例的，并且都是精确的。波长（因此频率）也与波的能量成正比，正如马克斯·普朗克（Max Planck）最初用下面的等式所描述的那样：

E = hc/λ

其中E是能量，H是普朗克常数，C是光速，λ是光的波长。这种关系表达了较短波长的光（即紫色）比较长波长的光（即红色）具有更多能量的想法。

荧光现象

图2：正常非洲绿猴肾成纤维细胞（CV-1）的三色TIRF图像。图片由佛罗里达州立大学国家强磁场实验室的迈克尔·W·戴维森提供

荧光是一种分子现象，其中一种物质在受到来自另一光源的光照射时几乎瞬间辐射出光能。来自该入射光的一些能量被该物质吸收，这意味着辐射光通常具有比光源更低的能量（因此波长更长）。光吸收和辐射的过程称为激发和发射。大多数有机和无机物质都表现出荧光，在荧光显微镜的早期（世纪之交），显微镜学家观察这种自然的初级荧光，称为自发荧光。

利用荧光作为成像模式已经成为研究人员，特别是生物和材料科学领域的研究人员研究以前在其他形式的显微镜下“看不见”的物质的宝贵工具。如上所述，生物学家可以用荧光分子对非常特定的亚细胞成分进行染色，使它们能够突出它们在细胞中的位置，并以非常高的分辨率研究潜在的分子相互作用。例如，图3中的图像是通过利用滤光器使三种不同的荧光染料与三种不同的细胞靶标的结合成像而得到的。在这张图片中，MitoTracker Red、Alexa Fluor 488和DAPI分别与细胞的线粒体、肌动蛋白丝和细胞核结合。

荧光染料光谱

下图说明了覆盖在同一图上的单一荧光染料的激发和发射光谱。将透射百分比绘制为激发和发射波长的函数。下面描述的是荧光光谱的几个一般特征，以及它们如何适用于荧光显微镜和滤光片设计。

首先，尽管一些物质具有非常宽的激发和发射光谱，但大多数荧光染料具有明确的激发和发射谱带。上图的光谱是一个典型的例子，并且这些谱带的峰值之间的波长差被称为斯托克斯位移。

第二，尽管发射的总强度随激发波长而变化，但发射光的光谱分布在很大程度上与激发波长无关。

第三，荧光染料的激发和发射可以随着细胞环境如pH水平、染料浓度和与其他物质结合的变化而改变。几种染料（例如Fura-2和Indo-1）是特别有用的，因为它们的激发或发射光谱随着离子如H+（pH水平）、Ca2+和Na+的浓度变化而有很大的位移。请注意，光谱是在标准化的非蜂窝环境中测量的。由于上述原因，细胞环境可能影响给定荧光染料的报告光谱的准确性。

最后，存在导致染料的荧光效率随时间降低的光化学反应，这种效应称为光漂白或褪色。这些光谱由称为荧光光谱仪的仪器产生，该仪器由两个光谱仪组成：照明光谱仪和分析光谱仪。首先，染料样品被发现引起一些荧光的光的颜色强烈照射。通过使用该固定照明颜色的分析光谱仪进行扫描，获得荧光发射的光谱。然后将分析仪固定在最亮的发射颜色，通过用照明光谱仪扫描并测量在该固定波长下发射强度的变化来获得激发光谱。为了设计滤波器，将这些光谱归一化为相对强度的标度。

透射、反射和吸收

当光照射到传播介质中的不连续处时，通过的波长被认为是透射的，而不通过的波长被认为是被阻挡或衰减的。当与荧光一起工作时，滤光器用作不连续性，并且可以被制成选择性地透射或阻挡某些波长。阻挡（衰减）可以通过滤光器反射或吸收光来实现，并且滤光器透射或衰减光的程度完全取决于其组成材料以及它们在其构造中的使用方式。

例如，光线通过棱镜后看到的彩虹是一种透射光谱。它是材料未能衰减（反射或吸收）的光的波长的可视化。

透射、反射和吸收都是可测量的属性，用于量化材料与光相互作用的方式。上图直观地突出了透射、反射和吸收的基本原理。

透射率和光密度百分比

透射百分比（%T）是用于定量表示滤光器如何透射光的最常用单位。透射百分比是在特定波长（或波长范围）下测量的，并且是透射光强度（I）与入射光强度（Io）的比率，表示为百分比：

%Tλ = I/Io * 100

下图说明了讨论以%Tλ表示的频谱时通常使用的术语。该图将在“滤波器特性”部分中进一步解释。

图5：传输术语

滤光器的衰减水平（阻挡水平）和衰减范围（阻挡范围）通常以光密度（OD）为单位定义。光密度使用与吸光度相同的单位，并表示为透射率的负对数。应该注意的是，人们不应该试图从透射图中推断光密度，这是那些从事荧光工作的人常犯的错误。数学表达：

OD= -log Tλ = -log [(%Tλ) / 100

Example: OD 4.5 = 3 x 10 -5 T (0.003 %T)

图6：衰减术语

荧光信号亮度

有几个因素影响染色样品在给定量的激发强度下发出的荧光量。其中包括：

1.样本染色切片内的染料浓度和样本厚度

2.染料的消光系数

3.染料的量子效率，

4.显微镜视野内实际存在的染色物质的量。

消光系数告诉我们有多少入射光将被给定染料吸收，并反映由荧光染料的激发光谱指示的波长相关吸收特性。发射随着更高的入射光吸收而增加，这意味着具有更大消光系数的荧光染料倾向于发射更强的光，并且需要更少的能量来充分激发它们。尽管许多荧光染料在峰值激发波长下具有高消光系数，但实际的样品制备技术通常限制样品中允许的最大浓度，从而减少被染色样品实际吸收的光的总量。在实验上，具有高消光系数的荧光染料的优点是能够使用合理量的激发光，同时避免负猝灭过程，例如光漂白。

量子效率，即吸收的光能与发射的荧光的比率，决定了多少吸收的光能将被转化为荧光。当今最常用的荧光染料的量子效率约为0.3-0.6，但实际值可能会因猝灭而降低。

除了许多样品在观察视场中具有非常少量的染色材料的事实之外，这些因素的乘积给出了在典型应用中发射的荧光强度与激发光强度的比率，对于非常高荧光样品，该比率在1/10000（10-4）和1/1000000（10-6）之间。利用微量荧光材料的当前技术（例如荧光原位杂交）可能具有低至10-9或10-10的比率。因此，为了看到具有足够对比度的荧光图像，荧光显微镜必须能够在不减弱荧光信号的情况下将激发光衰减多达10-11（对于非常弱的荧光）。这一概念在《荧光显微镜手册》中进一步讨论：荧光显微镜如何纠正这种不平衡？光学滤波器确实是必不可少的组件，但荧光显微镜的固有配置对滤波过程也有很大贡献。这种独特的配置是荧光显微镜部分讨论的主题，下期我们将讨论荧光滤光片及其特性。

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