实验原理 用纯化的NOS抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的NOS抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物(TMB)显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的NOS呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1、 酶标板：一块(96孔) 2、 标准品(冻干品)： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至1ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为400 U/ml，将其稀释为100 U/ml后，再做系列倍比稀释(注：不要直接在板中进行倍比稀释)，分别配制成100 U/ml，50 U/ml，25 U/ml，12.5 U/ml，6.25 U/ml，3.12 U/ml，1.56 U/ml，样品稀释液直接作为空白孔 0 U/ml。如配制50 U/ml标准品：取0.5ml (不要少于0.5ml )100 U/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3、 样品稀释液：1×20ml。 4、 检测稀释液A：1×10ml。 5、 检测稀释液B：1×10ml。 6、 检测溶液A：1×120 /瓶(1:100)。临用前以检测稀释液A 1:100稀释(如：10 检测溶液A / 990 检测稀释液A)，充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(100 /孔)，实际配制时应多配制 0.1-0.2ml。 7、 检测溶液B：1×120 /瓶(1:100)。临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。 8、 底物溶液：1×10ml/瓶。 9、 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10、终止液：1×10ml/瓶(2 mol/L H2SO4)。 11、覆膜：5张 12、使用说明书：1份 自备物品 1、 酶标仪(建议仪器使用前提前预热) 2、 微量加液器及吸头，EP管 3、 蒸馏水或去离子水，滤纸 标本的采集及保存 1、 血清：全血标本请于室温放置2小时或4 过夜后于1000 g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保存，但应避免反复冻融。 2、 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于 1000 g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保存，但应避免反复冻融。 3、 细胞培养物上清或其它生物标本：请1000 g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保存，但应避免反复冻融。 注：以上标本均应密封保存，4 保存应小于1周，-20 不应超过1个月，-80 不应超过2个月；标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 操作步骤 实验开始前，各试剂均应平衡至室温，试剂不能直接在37 溶解；试剂或样品配制时，均需充分混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。 1、 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100 ，余孔分别加标准品或待测样品100 ，注意不要有气泡，加样 时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37 温育2小时。为保证实验结果有效 性，每次实验请使用新的标准品溶液。 2、 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100 (临用前配制)，酶标板加上覆膜，37 温育1小时。 3、 弃去孔内液体，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分钟，大约400 /每孔，甩干(也可轻拍将孔内液体拍干)。 4、 每孔加检测溶液B工作液(临用前配制)100 ，加上覆膜，37 温育1小时。 5、 弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。 6、 每孔加底物溶液90 ，酶标板加上覆膜37 避光显色(反应时间控制在15-30分钟，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止)。 7、 每孔加终止溶液50 ，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物 液的加入顺序相同。 8、 立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。 注： 1、 试剂准备：所有试剂在使用前应平衡至室温，使用后请立即按照说明书要求保存试剂。实验操作中请使用一次性的吸头，避免交叉污染。 2、 加样：加样或加试剂时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预温育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。一次加样时间(包括标准品及所有样品)最好控制在10分钟内。推荐设置复孔进行实验。 3、 温育：为防止样品蒸发，实验时将加上盖或覆膜的酶标板置于湿盒内，以避免液体蒸发；洗板后应尽快进行下步操作，任何时侯都应避免酶标板处于干燥状态；同时应严格遵守给定的温育时间和温度。 4、 洗涤：洗涤过程中反应孔中残留的洗涤液应在滤纸上拍干，勿将滤纸直接放入反应孔中吸水，同时要消除板底残留的液体和手指印，避免影响最后的酶标仪读数。 5、 试剂配制：Detection A及Detection B在使用前请手甩几下或少时离心处理，以使管壁或瓶盖的液体沉积到管底。标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液请依据所需的量配制使用，并使用相应的稀释液配制，不能混淆。请精确 配制标准品及工作液，尽量不要微量配制(如吸取检测溶液A时，一次不要小于10 )，以避免由于不准确稀 释而造成浓度误差；请勿重复使用已稀释过的标准品、检测溶液A工作液、检测溶液B工作液。 6、 反应时间的控制：加入底物后请定时观察反应孔的颜色变化(比如，每隔10分钟)，如颜色较深，请提前加入终止液终止反应，避免反应过强从而影响酶标仪光密度读数。 7、 底物：底物请避光保存，在储存和温育时避免强光直接照射。 洗板方法 1、 手工洗板方法：将推荐的洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内，浸泡1-2分钟，吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体，在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；根据需要，重复此过程数次。 2、 自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中。 特异性 本试剂盒可同时检测重组或天然的犬NOS，且与其它相关蛋白无交叉反应。 计算 各标准品及样本OD值扣除空白孔OD值后作图(七点图)，如设置复孔，则应取其平均值计算。以标准品的浓度为纵坐标(对数坐标)，OD值为横坐标(对数坐标)，在对数坐标纸上绘出标准曲线。推荐使用专业制作曲线软件进行分析，如curve expert 1.3，根据样品OD值，由标准曲线查出相应的浓度，乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。 检测范围： 1.56 U/ml - 100 U/ml，绘制标准曲线请取用以下浓度值：100 U/ml，50 U/ml，25 U/ml，12.5 U/ml，6.25 U/ml，3.12 U/ml，1.56 U/ml。 最低检测限：0.78 U/ml 说明 1. 在储存及孵育过程中避免将试剂暴露在强光中。所有试剂瓶盖须盖紧以防止蒸发和污染，试剂避免受到微生物的污染，因为蛋白水解酶的干扰将导致出现错误的结果。 2. 小心吸取试剂并严格遵守给定的孵育时间和温度。请注意在吸取标本 / 标准品，酶结合物或底物时，第一个孔与最后一个孔加样之间的时间间隔如果太大，将会导致不同的 “预孵育”时间，从而明显地影响到测量值的准确性及重复性。而且，洗涤不充分将影响试验结果。 3. 试剂盒保存：部分试剂保存于-20℃，部分试剂保存于2-8℃，具体以标签上的标示为准。 4. 浓洗涤液会有盐析出，稀释时可在水浴中加温助溶。 5. 刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质，此为正常现象，不会对实验结果造成任何影响。 6. 中、英文说明书可能会有不一致之处，请以英文说明书为准。 7. 所有的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测装置。 8. 有效期：6个月