使用目的： 本试剂盒用于玉米、大米、麦类、豆类、花生、花生酱中黄曲霉毒素B1(AFB1)残留的定量检测。 2 实验原理 本试剂盒采用直接竞争ELISA方法，在微孔板包被有黄曲霉毒素B1(AFB1)偶联抗原，加入黄曲霉毒素B1(AFB1)标准品或样品，游离黄曲霉毒素B1(AFB1)微孔条上预包被的黄曲霉毒素B1(AFB1)偶联抗原互相竞争抗黄曲霉毒素B1(AFB1)体酶标记物，用TMB底物显色，加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，用酶标仪在450nm波长下进行检测，吸光值与样品中黄曲霉毒素B1(AFB1)含量成反比，通过标准曲线计算样品中黄曲霉毒素B1(AFB1)的含量。 3 试剂盒组成 3.1 预包被的黄曲霉毒素B1(AFB1)偶联抗原的可拆酶标板：1块(12孔×8条)。 3.2黄曲霉毒素B1(AFB1)标准品：6瓶(1ml/瓶)，含量分别是：0 ppb 0.2 ppb,0.6 ppb,1.8ppb,5.4ppb ,16.2ppb。 3.3抗黄曲霉毒素B1(AFB1)抗体酶结合物：1瓶(6ml)。 3.4显色液A：1瓶(6ml)。 3.5显色液B：1瓶(6ml)。 3.6终止液：1瓶(6ml)，2M硫酸。 3.7样本稀释液：1瓶(10×, 6ml)，用于样品稀释用。 3.8浓缩洗涤液：1瓶(20×，20ml)，用于洗板。 3.9说明书一份。 4 需要而未提供的材料 4.1 设备 4.1.1波长450nm酶标仪。 4.1.2粉碎机。 4.1.3量筒。 4.1.4振荡器。 4.1.5漏斗。 4.1.6Whatman No 1或相当的滤纸。 4.1.7微量移液器。 4.2 试剂 4.2.1去离子水或蒸馏水。 4.2.2 甲醇。 5 贮存 5.1 试剂盒贮存于2~8℃，切勿冷冻 5.2 未用完的微孔板应该密封干燥保存 6 注意事项 6.1 使用试剂盒前请仔细阅读说明书。 6.2 不要使用过期试剂盒。 6.3 试剂盒使用前，将试剂恢复至室温(25±2℃)，建议至少回温2小时。 6.4 标准品中含有黄曲霉毒素B1(AFB1)，使用时应特别注意，操作时应带手套。 6.5 终止液中含有硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。 6.6 不同标准品、样品所用吸头不能混用，否则会影响试验结果。 6.7 不同批号试剂盒中的试剂不得混用；不同标准品、样品所用吸头不得混用，否则会影响实验结果。 6.8 稀释样本时必须用本试剂盒中的样本稀释液，否则会影响实验结果 6.9 混合试剂时应避免起泡。 7 工作液准备 7.1黄曲霉毒素B1(AFB1)标准品溶液：0 ppb 0.2 ppb,0.6 ppb,1.8ppb,5.4ppb ,16.2ppb 7.2 浓缩洗涤液：用蒸馏水按1:20(1+19)稀释备用 7.3 样本稀释液：已备用 7.3 显色剂：已备用，避免光线直照 7.4 反应终止液：已备用 8 样品处理：(样品在提取过程中，要严格按说明书操作，提取过程中应准确稀释，否则会出现结果不准确，样品应当保存在阴凉避光之处及冷藏保存) 一般样品处理 8.1取10g粉碎的样品，加 20ml 70%甲醇溶液 8.2强力振荡3分钟 8.3用Whatman No 1滤纸过滤 8.4取100µl处理后的样品，加入400µl样本稀释液 8.5取100μl稀释液进行分析 动物组织前处理 8.6准确称取1±0.05 g匀浆后的组织样品到50 ml的聚苯乙烯离心管中；加入3ml乙腈--丙酮提取溶液，2000rpm剧烈震荡20s后4000r/min以上离心5min 8.7取上清液0.8ml在50℃氮气流下吹干 8.8加入3.2mL样品稀释液, 750rpm涡旋20s 8.9取100ml用于分析 饲料前处理方法 8.10准确称取1±0.05 g粉碎饲料样品到50 ml的聚苯乙烯离心管中；加入4ml乙腈，1ml丙酮，2000rpm剧烈震荡20s后4000r/min以上离心3min 8.11取上清液0.7ml在50℃氮气流下吹干 8.12加入2.8mL样品稀释液,涡旋20s，混匀后取100ml用于分析 牛奶前处理方法 8.13取1 ml牛奶样品到5 ml聚苯乙烯离心管中；加入4ml样品稀释液，混匀后取100ml用于分析 奶粉前处理方法 8.14准确称取0.3g奶粉样品到7 ml的聚苯乙烯离心管中；加入2ml PBS溶液，2 ml正己烷，震荡混匀 8.154000r/min以上离心5min，去除有机层和中间层，取下层溶液100ml到400ml 样品稀释液 8.16混匀后取100ml用于分析 9 酶免分析步骤 9.1 实验须知 9.1.1 实验开始前请将所有试剂于盒外充分恢复至室温(25±2℃)，时间约2小时。回温至室温(25±2℃)后再取出微孔条，多余的微孔条重新密封立即于2~8℃干燥保存 注：一定保证回温充分，否则影响检测的精确度和准确度。 9.1.2 使用后请立即将试剂放回2~8℃保存 9.1.3 请不要改变分析程序 9.1.4 请使用精确的微量移液器 9.1.5 操作一旦开始，请不要中断任何程序 9.1.6 ELISA结果的可重复性极大程度的取决于操作程序，请严格按照要求操作 9.1.7 为避免交叉污染，每个标准品和样品均应使用不同的吸头加样 9.1.8 加样时请勿让吸头接触微孔中的溶液或内表面 9.2 分析步骤 9.2.1 预先进行编号，标记B0、标准品和样品的位置，推荐进行双孔检测 9.2.2 取所需数量的微孔(微孔条可拆)，将多余板条重新密封并立即放回2~8℃保存 9.2.3 样品稀释液、浓缩洗涤液(20×)稀释成工作液(蒸馏水或去离子水稀释) 9.2.4 在B0孔中加入50µl0.0 ppb标准品溶液 9.2.5 在各标准孔中加入50μl的标准品溶液 9.2.6 在各样品孔中加入50µl样品溶液 9.2.7 在所有孔中加入50µl的抗黄曲霉毒素B1(AFB1)抗体酶结合物 9.2.8 轻轻晃动反应板几秒钟。 9.3 37℃温浴30min (温浴过程中不时轻拍反应板，可以减少双孔误差) 9.3.1 甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板5次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。 9.4 反应 9.4.1 洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50µl显色液A，再加 50µl显色液B；轻微晃动反应板使之彻底混匀 9.4.2 37℃温浴10min 9.4.3 每孔中加入50µl终止液，混匀 9.4.4 在450nm下检测吸光度，结果在5min内读取。 10 结果计算 10.1定量分析 10.1.1所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100%，即百分吸光度值。 B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B0—0 ppb标准溶液的平均吸光度值 10.1.2以黄曲霉毒素B1(AFB1)浓度的对数值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。根据样品百分吸光度值，可从曲线上得到对应点的横坐标，即为黄曲霉毒素B1(AFB1)浓度的对数值，求得反对数即为测定液中黄曲霉毒素B1(AFB1)浓度C(ppb) 10.1.3由于样品经过了预先稀释，因此根据标准曲线所得出的样品浓度一定要再乘以其稀释倍数。 10.2 半定量测定 10.1.1目测半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品吸光度值的高低比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。 10.1.2仪器半定量测定：首先选择一个适当的标准液与样品同运行，根据样品与标准品颜色深浅比较，判断样品浓度值是小于还是大于标准值。 11 特异性 物质 交叉反应 黄曲霉毒素B1(AFB1)100% 12 试剂盒参数 本试剂盒检测下限为0.2 ppb B0吸光度最佳值应大于1.0 试剂盒吸光度板内误差小于8％，板间误差小于15％。 用本说明书提供的组织样本提取方法回收率大于80％。