产品编号：P38
检测卡定性测定黄曲霉毒素B1，B2,G1,G2。检测限可以用稀释方法分别调整为4，5，10，15，20或30ppb，参见样品提取章节
使用说明书，使用前请仔细阅读，中文翻译件仅供参考 试剂盒组成，可以进行20个样品的测定 10 个卡 密封于铝箔袋中，每卡可以测定两个样品 20个样品纯化柱 20个样品瓶，每瓶含有3ml样品稀释缓冲液 1瓶洗涤缓冲液，4ml 绿色标签 1瓶停止液，4ml 黄色标签 2 个安瓶，含有冷冻干燥的酶标记物，红色标签 1瓶酶标记物稀释缓冲液，5ml 粉色标签 1个安瓶，含有5ml 底物，兰色标签 20个滤液收集管 20个有刻度的稀释管 需要的材料但盒子中不提供 实验室天平 刀片式均质器，带有1L容器罐 蒸馏水或去离子水 色谱级甲醇 Whatman N0113或 N04滤纸（可用国产定性或定量滤纸替代）
100ul, 0.5-1.0ml移液器及匹配的吸头 实验室玻璃容器 过滤漏斗 100ml及500ml量筒 烧杯 重要注意事项 避免危险 黄曲霉毒素是非常有害的物质,在实验中应当自始致终穿戴保护服装,包括橡胶手套,安全眼镜,实验大褂. 防止污染 所有使用过的材料及试剂必须经过次氯酸钠溶液（约5%W/W）浸泡至少30分钟,然后加入丙酮（5%V/V） 再浸泡30分钟.以达到消毒的目的. 重复使用的实验用具应当用清水冲洗干净后用蒸馏水彻底洗涤. 特别提示 1.不要使用过了有效期的试剂盒 2.不要混用不同批号的试剂,不要使用其他厂商的试剂代替. 3.试剂盒在使用之前应当回至室温（20-28OC）,需要至少30分钟
4.避免试剂长时间在室温放置,取出所需要的试剂后,其余应立即密封好放回2-8OC
5.如果孵育时间与要求的不符,会导致结果不准确. 6. 移液器吸头在使用之前应当用原液润湿 7.蒸馏水温度应当为室温（20-28OC）
储存 试剂盒应当在2-8OC保存,不要冷冻
效期 如果试剂盒是在2-8OC保存, 自生产之日起有十个月的效期。酶标记物复溶后在2-8OC保存，可稳定4个月
样品制备 应当按照官方认可的正式取样程序取样，以获得有代表性的样品。推荐最少粉碎1公斤有代表性的样品，其中50g用于样品提取 用途及原理 AFLACARD TOTAL速测卡是定性酶免疫方法。这个筛选方法用于检测总黄曲霉毒素的含量是否等于或大于4，5，10，15，20或30ppb。 由于传统的黄曲霉毒素检测方法耗时长，成本高，已经不适应产品的常规检测。速测卡由于采用了单克隆抗体技术，因而具有特异性好，灵敏度高，快速，简单等优点 速测卡的关键组份是单克隆抗体联接在卡的膜上。接下来是毒素提取，样品过柱纯化或是在稀释前或是在稀释后，这主要取决于样品的种类。样品中的黄曲霉毒素被膜上的抗体结合，剩余的抗体空位与后加入的黄曲霉毒素酶标记物结合，然后洗涤膜以除去未结合的酶标记物。加入底物后，膜上结合有酶标记物的地方会显现紫色斑点。用于质控的紫色斑点确认实验进行正确。样品紫色斑点产生表明是阴性样品。加入反应停止液后，颜色反应会终止并留下永久的实验记录（保存在黑暗处）。
测定程序 酶标记物的准备 加2ml酶标记物稀释缓冲液（粉色标签）到含有酶标记物的安瓶中（红色标签），复溶后使用前在室温（20-28OC）放置至少30分钟。如果不能当日消耗完，请转移到另一干净棕色可密封的瓶中，标记好内含物及复溶日期，在2-8OC保存。
酶标记物复溶后在2-8OC保存，可稳定4个月
样品提取 称50g精细粉碎了的样品，放入具有1L容量的均质器中。加入100ml 80%的甲醇水溶液（色谱级甲醇/蒸馏水， 80/20 V/V）。高速均质2分钟。用滤纸过滤提取物，收集至少10ml滤液。 花生，谷物样品的纯化及稀释 注意：花生/谷物样品应当在过柱纯化后稀释
取5ml滤液加入纯化柱中（盒中已提供），用活塞加压滴速通过纯化柱并收集纯化液于收集管中（盒中已提供）。如果纯化液不清亮，请用同一根柱子再次过柱，但要降低速度。 确定了检测限后，根据表1取适量的纯化液及 80%甲醇加入到盒中已提供的刻度稀释管中，颠倒数次混合好。取1ml稀释了的纯化液转移到含有3ml样品稀释缓冲液的小瓶中，颠倒小瓶数次混合好。此液可以用AFLACARD TOTAL检测卡测定。 饲料及各种调味品的稀释及纯化 注意：饲料及各种调味品应当在过柱纯化前稀释
确定了检测限后，根据表1取适量的滤液及 80%甲醇加入到盒中已提供的刻度稀释管中，颠倒数次混合好。取1ml稀释了的滤液转移到含有3ml样品稀释缓冲液的小瓶中，颠倒小瓶数次混合好。将瓶中液体转移入纯化柱中（盒中已提供），用活塞加压滴速通过纯化柱并收集纯化液于收集管中（盒中已提供）。如果纯化液不清亮，请用同一根柱子再次过柱，但要降低速度。此液可以用AFLACARD TOTAL检测卡测定。 表1
稀释体积配比
|
要求的
检测限 |
4ppb |
5ppb |
10ppb |
15ppb |
20ppb |
30ppb |
被稀释物
体积 |
1ml |
1ml |
1ml |
1ml |
1ml |
0.5ml |
80%甲醇
体积 |
1ml |
1.5ml |
4ml |
6.5ml |
9ml |
7ml |
AFLACARD TOTAL检测卡测定程序 注意：每卡有两个孔，因此每卡可以测定两个样品。第二个孔必须在第一个孔用后的8小时内使用。每孔各有一个样品区和质控区 1． 试剂盒在使用之前从冰箱中拿出，回升至室温（20-28OC）,需要至少30分钟
2． 检查卡的每个孔是否有两个亮兰色的斑点。未曾使用的卡每个孔内有两个浅兰色的斑点，加入样品后会自动消失。
3． 用移液器吸取500ul纯化及稀释过的液体，加入到速测卡膜的中间，使其透过膜（见附图1. 这一过程需要的时间不会超过5分钟）
4． 当滤液透过膜后,加入100ul准备好的酶标记物复溶液到膜的中间, 使其透过膜
5． 当酶标记物透过膜后, 加入100ul洗涤缓冲液（绿色标签） 到膜的中间,使其透过膜,然后用柔软的吸水纸（优质纸手巾）沿孔的周围擦拭
6． 加入100ul底物（兰色标签）到膜的中间,反应5分钟,加入底物后开始记时（严格控制反应时间）
7． 加入100ul停止液（黄色标签） 到膜的中间,当停止液透过膜后立即判读结果
判读测定结果 为了获得一个有效的测定结果，质控斑点必须变成清晰可见的紫色。样品斑点与质控斑点颜色的强度不必一样。 当样品斑点与质控斑点都有清晰可见的颜色产生，样品应当判断为阴性（小于所选择的检测限） 当样品斑点没有产生易见的颜色，应当判断为阳性（大于所选择的检测限） 成功使用AFLACARD TOTAL速测卡指南 l 试剂盒在使用之前回升至室温（20-28OC）,需要至少30分钟
l 酶标记物复溶后至使用前在室温（20-28OC）放置至少30分钟, 以混合均匀
l 每次吸样或吸试剂必须使用新的移液器吸头，吸头不能反复使用，应使用高质量的吸头
l 确认加入到膜上的底物中没有气泡
l 在孵育反应5分钟步骤，请使用记时器
以上为永远遵循的要点，永远！ 
