抗体片段(F(ab’)2)的制备-TSKgel G3000SWXL的分析监测BIO-013

抗体片段(F(ab’)2)的制备 

 
抗体的 F(ab’)2 片段化是一种提高抗体穿透性、减少对 ELISA 的非特异性吸附以及获得其他多种目的而被广泛采用的方法。对于 F(ab’)2 片段的制备，胃蛋白酶的使用非常普遍。但不同种类或亚种类的抗体，对胃蛋白酶的敏感程度是不同的。因此，在酶切/消化反应的初期，对反应条件(如 pH 或反应时间等)进行优化是需要的。本数据中介绍了一款特别适合于蛋白分析的 TSKgel  G3000SW XL 分子尺寸排阻色谱柱，对使用胃蛋白酶进行老鼠单克隆抗体 lgG1 酶切/消化时，单抗随时间变化情况的分析应用。 

色谱条件 
色谱柱         : TSKgel G3000SW XL  (7.8mmI.D. x 30cm) 
流动相         : 20mmol/L Phosphate + 0.3mol/L NaCl (pH7.0) 
流速  : 1.0mL/min 
检测  : UV (280nm) 
温度  : 25C 
进样体积      : 20μL 
样品浓度      : 0.192g/L 
液相色谱仪   : Agilent 1120 Compact LC (gradient auto system) 
程序  :   
胃蛋白酶酶切/消化反应是在 0.1mol/L 的柠檬酸盐缓冲液(pH3.7)  中，37 度的温度下进行的。 
在 5g/L 的抗体溶液中，加入 40 单位的胃蛋白酶(Sigma P7012,1g/L)/mg 并孵化。 
当酶切/消化反应分别进行到 2, 5, 10, 30 和 60 分钟时，取 40uL 的反应溶液并立刻加入 10uL 的 3mol/L 的 Tris(羟甲基)-氨基甲烷以阻止酶切/消化反应继续进行。   
上述 50uL 停止反应的溶液中，加入 990uL 的 20mmol/L  磷酸缓冲液+0.3mol/L NaCl(pH7.0)稀释后，进样分析。