选择合适的填料和固定相，会对色谱分析及制备实验起到事半功倍的作用。了解固定相常见的键合方式及其修饰，是熟悉各个不同类型色谱柱使用条件的“必修课”，更能减少试错成本、提高方法开发效率。制备反相色谱柱填料常用的方法是采用有机硅烷，使其与硅胶颗粒表面上的硅醇发生共价反应，来生成固定相或者配合基R，也就是我们常说的键合工艺。通过不同的键合反应，才产生了丰富的固定相选择。

X3-Si-R+≡Si-OH→≡Si-O-Si（X2）-R+HX

（硅烷）（硅烷醇）（固定相）

图：Luna系列产品丰富多样的固定相和选择性

硅胶颗粒的性质差异、键合工艺方式方法的差异共同决定了填料的性质。选择填料参数时通常会按照哪些维度进行选择呢？下表列出了表征填料性质常见的参数及其代表符号和常见单位。

	符号	常见单位	实例：Luna C18(3)参数
粒径	D_P	μm	10μm
比表面积	S_BET	m²/g	400m²/g
孔体积	V_P	mL/g	1mL/g
孔径	D	Å	100Å
粒径分布	-	-	dp90/dp10≤1.6
化学纯度（金属含量）	-	ppm	总金属含量≤20ppm
C载量及键和密度	-	%及μmol/m²	17% C, 3μmol/m²
装填密度	-	g/mL	0.60g/mL
pH耐受范围	pH	-	1.5-10*
机械强度	-	bar/psi	可反复填装，最高达140Bar（2000psi）

*等度条件下的pH范围。梯度条件下的pH范围为1.5-9。

自从Kovats等色谱研究先驱采用Cab-O-Sil和N, N-二甲氨基十八烷基硅烷为改性剂证明键和密度最高约为aRP=4.2 to 4.3μmol/m²，色谱工作者对固定相键和密度的改善从未停止过。成功的商业化填料不仅要追求适度的键和密度，更要提高工艺流程的稳定性，使得产品参数稳定可控。Luna C18(3)填料采用了飞诺美独有的键合技术，拥有很高的配体表面密度，从而实现很宽的pH稳定范围（1.5到10.0）。精心优化的键合密度，实现出色的可重现性。

在pH1.5条件下持续运行超过1000小时，依旧保持高化学稳定性

测试条件：在强酸性条件下对色谱柱稳定性进行测试。在含0.1%TFA(pH1.5)的乙腈/水溶液(50:50)中连续冲洗。

在pH10.0条件下持续运行超过1000小时，依旧保持高化学稳定性

测试条件：在强碱性条件下对色谱柱稳定性进行测试。在含20mM Na₂HPO₄(pH10)的乙腈/水溶液(50:50)中连续冲洗。

填料的各参数表征还会用到多种实验手段。填料的表面积通常是通过低温氮气（或惰性气体）在其沸点处的等温吸附线来表征，氮气的等温吸附线通常为S形。通过曲线的斜率和截距可以计算出单层吸附气体的体积，从而表征出吸附剂的表面积。多孔结构的表征可以使用比重法。碳元素的含量通常来自元素分析的结果，而键和密度又可以从总的碳含量计算出来。

飞诺美质量管理体系经过ISO 9001:2015认证。工艺均完善、可行，并符合有关可预测性能的国际标准，可以满足cGMP水平的项目要求。在Luna C18(3)填料的工艺中，更大的孔体积带来更大的比表面积，填料的高比表面积使载样量进一步提高。

【Phenomenex Bulk media/Applications】

利拉鲁肽在Luna C8(3)上的2步纯化

步骤1条件

色谱柱：Luna 10μm-PREP C8(3)

规格：250x4.6mm

货号：00G-4623-E0

流动相：

A：10mM氢氧化铵水溶液(pH6.9)+10%乙醇

B：90%乙腈+10%乙醇

梯度：

时间(min)	%B
0	33
25	43
26	67

流速：1.5mL/min

载样：0.3mg粗样品

温度：30℃

检测：UV@220nm

馏分	1	2	3	4	5
%纯度	94.7	95.9	91.6	81.3	74.5
%产率	28	25	18	12	7

分析条件

色谱柱：Kinetex^® 5μm Biphenyl

规格：150x4.6mm

货号：00F-4627-E0

流动相：

A：0.1%TFA水溶液

B：0.1%TFA甲醇溶液

梯度：5分钟内50到60%B

流速：1mL/min

温度：室温

检测：UV@254nm

精制步骤

步骤2条件

色谱柱：Luna 10μm-PREP C8(3)

规格：250x4.6mm

货号：00G-4623-E0

流动相：

A：0.1%TFA水溶液

B：0.1%TFA乙腈溶液

梯度：20分钟内35到55%B

流速：1.5mL/min

进样量：1mL(手动)

温度：室温

检测：UV@220nm

样品：步骤1的馏分@12mg/mL

分析条件

色谱柱：Kinetex 5μm Biphenyl

规格：150x4.6mm

货号：00F-4627-E0

流动相：

A：0.1%TFA水溶液

B：乙腈

C：乙醇

梯度：2分钟内34到45%B，含25%C

流速：1.0mL/min

温度：40℃

检测：UV@254nm

Luna 10μm-PREP Polar-RP上的药物化合物混合物

色谱柱：Luna 10μm-PREP Polar-RP

规格：250x4.6mm

货号：00G-4757-E0

流动相：

A：0.1%TFA水溶液

B：乙腈

梯度：

时间(min)	%B
0	10
1	10
5	65
10	100
13	10
15	10

流速：2mL/min

温度：25℃

检测：UV@254nm

样品：专用药物混合物

Luna 10μm-PREP C18(3)上的药物化合物混合物

色谱柱：Luna 10μm-PREP C18(3)

规格：250x4.6mm

货号：00G-4616-E0

流动相：

A：0.1%TFA水溶液

B：乙腈

梯度：

时间(min)	%B
0	10
1	10
5	65
10	100
13	10
15	10

流速：2mL/min

温度：25℃

检测：UV@210nm

样品：专用药物混合物

对25mer寡核苷酸的反相离子对纯化

色谱柱：Gemini 10μm C8(3)

规格：250x10mm

货号：00G-4763-N0

流动相：

A：0.1M TEA碳酸盐缓冲液，pH8-9

B：乙腈

梯度：30分钟内26-38%(13.5-43.5分钟，然后进行等度载样、碱洗以及平衡)

流速：5mL/min

检测：UV@260nm

进样量：1μmol

样品：25mer寡核苷酸

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参考来源

E. sz. Kovats, K. Szabo, N. Ha Le, Ph. Schneider, P. Zeltner, Helv.Chim. Acta 1984, 67, 2126.

L.C. Sander, S.A.Wise, CRC, Crit. Rev. Anal. Chem. 1978, 18, 299.

B. Buszewski, Processes of chemical modification of silicas.UMCS, Lublin 1990.

J.M. Drake, J. Klafter, P. Levitz, Chemically Modified Surfaces, Elsevier, Amsterdam 1992.

J.G. Dorsey, W.T. Cooper, Anal. Chem. 1994, 66, 857 A.

Boguslaw Buszewski, Marta Jezierska, J. High Resol. Chromatogr. VOL. 21, MAY 1998