合成多肽的反相纯化 | 艾塞那肽纯化案例
合成多肽的粗品纯化通常采用多步纯化过程。第一步除去大多数杂质，然后是通过二次精纯以达到所需的纯度。如果工艺合适，单步纯化即可完成的话，可以节省大量时间和成本达到必要的纯度，同时保持理想的收率和上样量。如果使用相同的固定相进行多步纯化，与使用多种固定相相比，也可提供可观的时间和成本的节省。
当采用多步色谱纯化时，常规构思是使用两种或两种以上的互补模式色谱，比如离子交换凝胶渗透、亲和，和反相配合，以利用它们不同的选择性。改变固定相是一个获得不同的选择性的有效方法，但这会让大批次的纯化成本提高，耗时增加。通常来说，多肽的性质允许调整pH值或选择不同的有机溶剂以达到改变选择性的目的，而这些改变的成本相对较低而且很容易实现。
艾塞那肽（Exenatide）纯化案例
艾塞那肽（Exenatide）是一种由39个氨基酸组成的多肽类胰高血糖素激动剂，于2005年4月被批准用于治疗糖尿病2型，化学结构如图1所示。
图1.艾塞那肽的化学结构式
Luna 10μm-PREP C8的流动相筛选
艾塞那肽是相对非极性的，首选Luna C8作为固定相，并用乙腈作为强溶剂。目标物的等电点为4.38，包含6个酸性侧链和4个碱性侧链，推断pH值变化可能改变艾塞那肽及其相关杂质之间的选择性。初步筛选评估4种不同的水相【pH值范围为2-8】(图2)。
色谱柱：Luna 10μm-PREP C8(3) 100Å
规格：250x4.6mm
货号：00G-4623-E0
流动相：
A: 如图所示
B: 100%乙腈
流速：1.5mL/min
进样量：10μL @ 40mg/mL
温度：室温
波长：UV @ 220nm
梯度：B在10分钟内从25%变成45%，然后在1分钟内从45%变成70%，70%B保持1分钟
图2.不同pH条件下的初步筛选结果
图3.不同pH洗脱液的优化梯度
图4.不同流动相的筛选结果
色谱柱：Luna 10μm-PREP C8(3) 100Å
规格：250x4.6mm
货号：00G-4623-E0
流动相：A: 如图所示；B: 100%乙睛
梯度：如图所示
流速：1.5mL/min
进样量：40μL @ 40mg/mL
温度：室温
波长：UV @ 220nm
色谱柱：Kinetex 5μm EVO C18
规格：150x4.6mm
货号：00F-4633-E0
流动相：A: 0.1%TFA水溶液；B: 100%乙睛
梯度：B在5分钟内从15%变成30%，然后在0.5分钟内从30%变成50%，50%B保持2分钟
流速：2.0mL/min
进样量：5μL
温度：室温
波长：UV @ 220nm
小试后用Kinetex EVO分析(图4)。可以看到一步纯化没有满足98.5%的纯度，并且期望的最终产品是醋酸盐，所以在二次精纯时需要使用醋酸盐优化。
结果和讨论
两步法纯化，纯度>98.5%原始原料的纯度估计为66%，使用Kinetex EVO作为分析柱（图5）。第一步进行了简单的上样量研究并在条件下确定了粗品1%上样量没有问题（图6）。收集第一步的主峰馏分收集，进行分析，纯度为96.5%。第二步切换醋酸盐，收集主峰，浓缩冻干，HPLC分析成品纯度为99.3%。
图5.Kinetex EVO分析初始粗品纯度
色谱柱：Luna 10μm-PREP C8(3) 100Å
规格：250x4.6mm
货号：00G-4623-E0
流动相：
A: 0.5%TFA水溶液
B: 乙腈
流速：1.5mL/min
温度：室温
波长：UV @ 220nm
梯度：
Time/min
B%0311036124113751475
色谱柱：Luna 10μm-PREP C8(3) 100Å
规格：250x4.6mm
货号：00G-4623-E0
流动相：
A: 0.5%乙酸铵水溶液(pH4.6)
B: 乙腈
流速：1.5mL/min
温度：室温
波长：UV @ 220nm
梯度：
Time/min
B%030154016801780
图6.艾塞那肽粗品的多级纯化工艺
当然小试成功，最终还需要考察上样量在最终批次上的优化，许多因素都会影响制备色谱柱的载量。
更多应用案例，
飞诺美MDS实验室小贴士：
01
肽的载量主要取决于具体样品的溶解性。
02
如果需要较高的分离度，应降低载量。
03
载量取决于上样条件，但小分子样品受此影响相对较小。
a) 肽上样一般在高水相条件下进行，通常会添加TFA。在这种条件下，体积载量几乎是无限的。载量受限于洗脱过程中的溶解性。
b) 干燥的肽可用DMF或DMSO等溶剂溶解。接下来通常使用TFA水溶液进行稀释。
c) 在某些情况下，会先将肽溶于DMF或DMSO，然后再注入上述溶液。
04
合理的进样体积由采用相对较强的溶剂时50mm柱长的色谱柱直径决定。增加柱长可兼容更大的进样体积，但二者并不成比例。使用较弱的溶剂时需要大幅增加进样体积。
05
需要根据色谱柱直径选择合理的流速。柱长越长、粒径越小，柱压就越大，系统受到的限制也就越大。部分用户倾向于采用比分离小分子时更慢的流速来分离肽，因此会采用推荐流速1/2的流速，同时将梯度持续时间翻倍。
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