寡聚核苷酸在治疗领域的研发热度正在不断攀升，研发出的新分子药物长度和复杂性也不断增加，快速准确地确定新分子药物杂质谱是研发过程中的棘手挑战。目前，最广泛用于分析合成寡核苷酸杂质的方法是Ionis Pharmaceuticals开发的HPLC离子对RP-UV-单四极杆质谱法。然而，该分析方法在分析更长和更复杂的寡核苷酸时存在明显不足 - 耗时较长、存在需要手动处理的步骤，不适合用于分析复杂样品杂质，不仅存在引入人为错误的风险，而且不便于在受监管的环境中实施。复杂繁琐的处理步骤导致了新用户需经过长时间培训，并限制了检测通量。

为了满足不断增长和发展的寡核苷酸药物管线的分析需求，沃特世公司推出了一种基于UPLC-Tof MS技术的寡核苷酸杂质分析工作流程。该方法利用ACQUITY Premier UPLC系统提供的快速分离技术，减少溶剂消耗和有毒废物的产生，提高分离质量和分析通量；利用BioAccord系统的高分辨率质量检测能力，显著减少杂质鉴定的测量误差，并改善质量差异很小的杂质的检测。例如，序列杂质n-U和n-C的质量仅相差约1 Da，在-4电荷状态下，它们的 m/z 值(分别是1681.046和1681.2928)非常相近，传统单四极杆质谱方法难以区分，但高分辨质谱新方法能够轻松分辨。

图1.寡核苷酸杂质分析工作流程包中使用的两种数据分析流程。

如图1所示，数据处理方法由两个关键工作流组成：靶向杂质分析工作流程和非靶向杂质分析工作流程。靶向工作流程通过质谱数据提取离子流(XIC)检测和定量已知杂质；通过UV积分数据定量与FLP色谱分离的峰的未知杂质。非靶向工作流程包括使用m/z信息定量识别与FLP共洗脱的未知杂质；通过质谱数据提取离子流(XIC)检测和定量未知杂质。

方案优势

高效工作流程：本解决方案显著简化了数据分析流程，将原本耗时数小时的分析任务缩短至数分钟，极大提升了工作效率。

自动化与合规性：通过waters_connect Informatics平台，数据处理过程实现了高度自动化，并确保了合规性，有效降低了人为错误的风险。

用户友好与可扩展性：该方法易于使用，无需复杂的专业知识或长时间的培训，同时具备高度的可扩展性，使更多用户能够轻松上手并高效应用。

性能卓越：相较于传统单四极杆质谱平台，BioAccord系统或Xevo QTof MS在色谱和质谱性能方面均有所提升，为用户提供更为准确可靠的实验结果。

靶向杂质分析工作流程

设置FLP色谱峰UV积分的cut-off值；

自动计算标准样品的进样重复性结果并生成校准曲线；

通过UV积分对与FLP色谱分离的峰进行定量；

通过XIC积分对与FLP共洗脱的已知杂质峰进行定量，对比严苛电离条件和温和条件的图谱差异去除加和峰干扰。

图2.寡核苷酸靶向杂质分析工作流程步骤。

图3.使用靶向工作流程对标准品中FLP进行已知杂质定量。表格显示了校准曲线中包含的每次进样的信息。校准曲线(右下角)包括趋势线，R2表示拟合质量。

图4. 使用UV数据(上图)和从MS数据中提取的离子色谱图(XIC)(下图)分别定量色谱分离的杂质和已知的共洗脱杂质的积分结果。

图5. 比较靶向工作流程中的严苛电离与温和电离条件结果，以区分相同m/z的加合物和已知杂质。

非靶向(未知共洗脱组分)杂质分析工作流程

确认FLP的m/z与标准品中FLP或理论值m/z一致；

确认FLP钠离子加和峰相对强度小于FLP强度的指定阈值；

通过XIC积分对与FLP共洗脱的未知杂质峰进行筛查，对比严苛电离条件和温和条件的图谱差异去除加和峰干扰；

通过XIC积分定量与FLP共洗脱的未知杂质。

图6.寡核苷酸非靶向杂质分析工作流程步骤。

图7.寡核苷酸非靶向杂质分析工作流程对FLP进行识别测试。

图8.使用寡核苷酸非靶向杂质分析工作流程中对不同电离条件的结果进行镜像图对比，以区分相同m/z的加合物和杂质峰。

报告模板

寡核苷酸杂质分析工作流程数据包还包括报告模板，这些模板以清晰、简洁的方式总结数据，能够快速传达整合数据和结果。针对靶向和非靶向工作流程，将分别生成单独的报告。非靶向工作流程的示例报告页面包含一个标题页，显示分析的基本信息以及对系统适用性信息的总结；其他页面显示了与杂质定量相关的信息，例如列出所有检测到的杂质及其相对响应的表格；最终报告部分包含数据质量验证的信息，如每个定量杂质的单独提取离子色谱图。

图9.非靶向工作流程杂质分析设计的定制报告模板生成的例图。

随着合成寡核苷酸在治疗领域的重要性日益凸显，对复杂杂质谱进行快速准确分析的需求也随之增加。沃特世公司推出的创新解决方案，通过集成UPLC-Tof MS系统和合规的UNIFI应用程序，在waters_connect平台内实现了自动数据处理和优化的工作流程。这一方法克服了传统HPLC-单四极杆质谱法的不足，显著减少了手动数据分析的需求，提高了分析效率，降低了人为错误风险。该工作流程集成了多种分析方法，配备了现成的计算和报告模板，简化了用户输入，确保了数据的清晰呈现。这一解决方案易于适应不同合成寡核苷酸产品和杂质，为下一代寡核苷酸的治疗应用提供了强有力的分析工具和方法，引领了寡聚核苷酸杂质分析领域的新突破。

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