TaqDNAPolymerase
品牌 | 厂商性质 | 产地 | 货期 |
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概述
TaqDNA Polymerase是一种热稳定的DNA聚合酶,来源于嗜热细菌Thermus aquaticus。该酶具有5′-3′DNA聚合酶活性,还具有较低的5′-3′ 核酸外切酶活性,没有3′-5′的外切酶活性,在PCR产物的3′ 末端会加一个“A”,可用于TA克隆。
应用
1.常规PCR扩增反应,可扩增长达6kb的DN**段,通常适合扩增长度3kb以下的片段。
2.平端PCR产物3′ 末端加“A”。
3.DNA测序。
4.DNA3′ 末端标记。
来源
来源于Thermus aquaticusYT1的TaqDNA Polymerase基因的重组E. coli菌株。
活性单位定义
1单位(U)TaqDNA Polymerase活力定义为在72℃条件下,30min内,以活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物,催化掺入10nmol 脱氧核苷酸成为酸不溶性物质所需的酶量。
贮存条件
20 mMTris-HCl (pH8.0),100 mMKCl,0.1 mMEDTA,0.1 % NP-40 (v/v),0.1 % Tween-20 (v/v),1 mMDTT,50 %甘油(v/v),-20°C贮存。
10×TaqBuffer(with Mg2+)
100 mM Tris-HCl (PH 8.8)
500 mMKCl
15 mMMgCl2
1% Triton X-100
常规PCR反应条件
一.室温融化反应所需溶液后混匀并短暂离心至管底,连同TaqDNA聚合酶一起置于冰上。
二.按如下PCR反应体系(50μl)混合各溶液:
Template DNA | ×μl |
ForwardPrimer(10 μM) | 1 μl |
ReversePrimer(10 μM) | 1 μl |
dNTP Mixture(10 mMeach) | 1 μl |
10×Taq Buffer(with Mg2+) | 5 μl |
TaqDNA Polymerase(5U/μl) | 0.25 μl |
灭菌ddH2O | up to 50 μl |
人类基因组DNA | 50~500ng |
大肠杆菌基因组DNA | 5~50ng |
λDNA | 0.5~10ng |
质粒DNA | 0.1~5ng |
三.轻轻混匀反应液并短暂离心至管底,如果PCR仪没有热盖可加入一半体积的矿物油。
四.将PCR管放入PCR仪中,设置并运行PCR反应条件如下:
步骤 | 温度 | 时间 | 循环次数 |
预变性 | 94℃ | 3~5min | 1 |
变性 | 94℃ | 30s | 25~35 |
退火 | Tm-5℃ | 30s | |
延伸 | 72℃ | 1min/kb | |
最后延伸 | 72℃ | 5~15min | 1 |
质量控制
Forward primer:5-GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC-3
Reverse primer:5-AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA-3
PCR程序:94°C, 3 min; 35 cycles( 94°C, 30 sec; 55°C, 30 sec; 72°C, 45 sec); 72°C, 7 min
0.8%琼脂糖电泳检测没有544bp产物出现,表明通过该项检测。
质粒污染检测:
T7 Promoter Primer:5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3
T7 terminator Primer:5’-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3
PCR程序:94°C, 3 min; 35 cycles( 94°C, 30 sec; 55°C, 30 sec; 72°C, 45 sec); 72°C, 7 min
0.8%琼脂糖电泳检测没有PCR产物条带出现,表明通过该项检测。
支原体污染检测:
PCR产物::717 bp
GPO-1 :5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3
MGSO :5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3
PCR程序::94°C, 3 min; 35 cycles( 94°C, 30 sec; 55°C, 30 sec; 72°C, 45 sec); 72°C, 7 min
0.8%琼脂糖电泳检测没有PCR产物条带出现,表明通过该项检测。
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