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手把手教你攻克PCR困难模板
我太“南”了
PCR算是实验室最磨练耐心的实验之一了,好不容易完成了样品准备、核酸的提取,然而PCR之后没有产物,是漏加了试剂,还是酶失活?换上新试剂,格外小心,重来一次,没用啊!,依然P不出条带。内心无比凄凉,悲伤逆流成河。
本来做个PCR研究都够难了,现在还偏要碰到“困难模板”,小白不哭,没有条带不要着急,学姐总结经验,带你攻克各路PCR困难模板。
高GC含量模板
难点
DNA序列中,G-C之间的三对氢键通常需要较高能量解链,模板很难打开,易形成复杂的二级结构,DNA聚合酶难以推进。因此高GC含量(G+C>=60%)DNA序列在常规PCR条件下比较难扩增。
解决方案
选用专门针对GC-RICH PCR系统试剂盒:
包含高合成能力的DNA聚合酶,这类酶对DNA模板的亲和力较高,更适合扩增困难靶标添加1~2M betaine:
betaine在PCR混合液里可以保护DNA聚合酶免被高温变性伤害,还能促进DNA-蛋白质复合物的稳定,提高扩增效率。添加2~5% DMSO:
DMSO可以降低DNA的二级结构。但DMSO也会降低Taq polymerase的活性,因此DMSO的使用浓度需要优化。
产品推荐
货号 | 产品描述 | |
12140306001 | GC-RICH PCR System | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/12140306001?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
KK5702 | 2G Robust Hot Start Readymix | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/2grhsrmkb?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
B0300 | Betaine solution | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIGMA/B0300?lang=en®ion=US&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
D8418 | DMSO for molecular biology | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIGMA/D8418?lang=en®ion=US&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
长片段模板
难点
长片段DNA序列在PCR过程中易损伤,使其断裂或脱嘌呤,导致长片段PCR无法进行。Taq酶具有一定的错配率,导致产物链3‘端出现错配碱基,链合成提前终止。非特异性扩增也会干扰长片段的延伸。
解决方案
使用专为长片段PCR设计的PCR系统试剂盒:包含兼具矫正功能的DNA酶和高合成能力的DNA聚合酶,这类酶能够在短时间内扩增长片段。
设计较长的长片段PCR引物(21~34bp),提高反应特异性,减少错配率。
适当降低延伸温度,同时根据模板长度加长延伸反应时间(通常1kb/min)。
缓冲液体系需提高Tris的浓度或改用Tricine缓冲液以增强缓冲能力,使缓冲液的pH不会降的过低而影响酶活性。
产品推荐
货号 | 产品描述 | |
D1313 | JumpStart™ REDAccuTaq® LA DNA Polymerase | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/D1313?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
11732650001 | Expand High Fidelity PCR System | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/ehifiro?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
11681834001 | Expand™ Long Template PCR System | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ROCHE/ELONGRO?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
低纯度模板
难点
低纯度模板中可能含有PCR抑制剂残留,如蛋白酶K、苯.酚和EDTA;残留的盐分或离子,如K+,Na+等也可能会抑制DNA聚合酶,从而影响PCR扩增。
解决方案
选择合成能力高,对抑制剂耐受力高的DNA聚合酶,比如,把野生型Ta酶通过Directed Evolution工程化修饰的KAPA2G DNA聚合酶。
使用70%乙醇再纯化DNA,去除残留盐分或离子。
把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。
若存在EDTA或其它金属螯合剂时,需要适当提高能与EDTA结合的 Mg2+浓度。
产品推荐
货号 | 产品描述 | |
KK5024 | KAPA2G Robust PCR Kit | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/ROCHE/2GRKB?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
KK7252 | KAPA3G Plant PCR Kit | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/3gphskb?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
4655885001 | Transcriptor One-Step RT-PCR Kit | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/tosrtro?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
低浓度模板
难点
模板浓度是决定Ct的最主要因素,需控制在一个合适范围内,使Ct在15-35之间。低浓度模板不仅会影响PCR效率降低得率,甚至无扩增产物。
解决方案
选择高灵敏度,高合成能力的DNA聚合酶。
避免样制备中杂质的引入及反复冻融的情况。
再次扩增PCR产物,得到更高的目标DNA得率。
PCR扩增无产物时,可以适当提高Mg2+浓度(终浓度范围:1~4 mM)。
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货号 | 产品描述 | |
KK4601 | KAPA SYBR® FAST | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/sfukb?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
KK4702 | KAPA PROBE FAST | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/pfukb?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
4913914001 | FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) | https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/fsusgmmro?lang=zh®ion=CN&utm_campaign=China_LR1_Research_CN2020024&utm_medium=LLL-WeChat&utm_source=WeChat |
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