文献分享：iCIEF-HRMS在线直连技术用于蛋白质药物电荷异质性分析
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张晓夕
在整个制药行业中，重组单克隆抗体 (mAb) 为生物治疗产品在销售额和临床份额的快速增长起到了重要作用。最近，因为独特的治疗效果，复杂的蛋白质包括抗体-药物偶联物 (ADC)、双特异性抗体和融合蛋白等重新获得了科学家们的特别关注。在蛋白质药物的关键质量属性（critical quality attribute, CQA）评估过程中，电荷异质性需要对蛋白分子进行深入的结构表征，以确保其安全性、有效性和效力。
此外，对电荷变异体的监测也是蛋白质药物质量控制（QC）中必要的步骤。目前，主要有两种检测蛋白质药物电荷变异体的方法：离子交换(IEX) 色谱和成像毛细管等电聚焦(iCIEF) 或 CIEF，两者传统上都使用 紫外（UV） 作为检测器。UV检测虽然具有良好的稳定性和灵敏度，但受限于其定性能力，无法对分离后的电荷变异体进行更深入的鉴定。为了分析电荷异构体的成因，必须进行准确的定性分析。高分辨率质谱（HRMS）是定性蛋白质分析的有力手段之一。然而，由于所用溶液体系的限制，传统上IEX 和 iCIEF 不能直接与质谱连接。鉴于iCIEF在蛋白质电荷变异体分析中具有分辨率高、通量高等优点，已经逐渐成为生物制药行业生产与质量控制阶段的金标准。因此，科学家们也在尝试各种将iCIEF与高分辨质谱直接连接的技术。其中一种方法是基于芯片的直连技术，然而该方法是使用化学试剂形成pH梯度，稳定性有所欠缺，且分辨率会下降；其他的直连方法在通量、稳定性以及与质谱离子源连接的便利性等方面均有不足。
本文中所使用的CEInfinite (Advanced Electrophoresis Solution Ltd., AES) iCIEF平台，与该公司的专利卡柱和两性电解质配合使用，对mAb、ADC等分子的电荷变异体均可实现高分辨率分离，且兼具良好的稳定性。更为重要的是，所用溶液体系中无甲基纤维素、尿素等，两性电解质也与质谱兼容，这使得iCIEF与高分辨质谱在线直连测量电荷变异体完整蛋白分子量成为可能。该平台与质谱离子源部分连接简单，无需额外接口（图1），不同工作模式切换简便。
图1. CEInfinite iCIEF平台质谱直连模式工作原理图
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在本文中，我们对NIST mAb（NIST8671）、bevacizumab和pembrolizumab，以及T-DM1这一赖氨酸偶联的ADC药物进行了iCIEF-HRMS在线直连分析。根据每个分子及其电荷变异体的pI分布，我们选择了不同范围的两性电解质（表1），目的在于实现不同电荷变异体之间更好的分离。
表1. 样品配制
对于每个分子，我们也根据其不同性质优化了iCIEF实验条件，详见表2。
表2. iCIEF分离条件
实验条件的优化
由于每个蛋白及其电荷变异体的等电点（pI）分布范围存在差异，为了在直连质谱时得到最好的分离效果，需要进一步优化iCIEF分离条件。优化时，先用pH范围较宽的两性电解质分析目标蛋白得到初步结果，然后再根据初步结果中每个组分不同的pI分布范围，选用相应的窄pH范围两性电解质（优化过程数据未展示）。
在iCIEF的聚焦过程中，蛋白会在电场形成的pH梯度中迁移，直至到达pH=pI的位置，迁移停止。由于蛋白在pI处停止后易沉淀，通常会加入一定浓度的尿素助溶。然而尿素与质谱不兼容，为了解决这个问题，我们的实验中换用甲酰胺代替尿素，在助溶的同时，也与质谱兼容；对于每个样品，甲酰胺的浓度同样也进行了优化（数据未展示），对于大部分样品，10%(v/v)甲酰胺是最适合的条件。
在iCIEF-MS直连模式中，需要两路辅助溶剂。一路被称为mobilization solution（蛋白从卡柱上被推出的溶液，由iCIEF系统配备的蠕动泵完成），该溶液通常为10mM醋酸溶液或0.1-0.5%甲酸水溶液；另一路为make-up solution(由HPLC的泵模块提供，在柱后与mobilization混合) ，通常使用0.1%甲酸，水：乙腈=1：1的溶液。
因为这两路溶液的流速会对实验结果造成影响，我们同样对这两个流速分别进行了优化，mobilization solution流速优化范围30-100nL/min, make-up solution流速优化范围1-10μL/min，发现mobilization solution流速在40-50nL/min之间iCIEF分辨率最好，50-100nL/min分辨率会下降；mobilizaiton solution= 5μL/min，质谱灵敏度最好。
iCIEF-MS直连模式的重复性
在本实验中，NIST mAb被用于系统稳定性测试。如图2所示，图2A为NISTmAb三针平行进样结果，可见质谱总离子流图(total ion current, TIC chromatogram)和主峰解卷积结果均具有良好的重现性；图2B对NIST mAb的TIC和iCIEF-UV谱图进行了对比，可见iCIEF分离出的五个电荷异质体峰均可与TIC中的峰一一对应。需要注意的是，由于系统直连的模式，iCIEF分离后的峰是按照pI由大到小的顺序依次被引入质谱离子源的，故TIC图上最先被检测到的是pI值最大的碱峰，TIC与iCIEF-UV谱图中峰的分布呈镜像关系。
(A)
(B)
图2.iCIEF-MS系统稳定性测试。
(A)，NIST mAb三针平行进样。
(B)，NIST mAb 质谱总离子流图(TIC)与iCIEF-UV谱图对比。
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iCIEF-MS分析bevacizumab
图3展示了iCIEF-MS分析bevacizumab的结果。从图3A的iCIEF-UV谱图中可以看出，总共有六个电荷变异体的峰被分离并鉴定到，包括三个酸峰(A1-A3)，两个碱峰(B1-B2)和主峰(M)，均可在TIC-MS谱图中找到对应的峰。图3B为使用Thermo Fisher Biopharma Finder 5.0 (BPF 5.0)软件对各个电荷变异体进行解卷积之后的结果，可见在两个碱峰中，主要的电荷变异体分别为重链末端保留一个赖氨酸(B1)和两个赖氨酸均被保留(B2)的形式；在酸峰中，主要观察到的电荷变异体为糖化(+162Da)。
表3列出了iCIEF-MS鉴定到的bevacizumab电荷变异体。对于酸峰中常见的脱酰胺化修饰，由于其修饰后分子量仅增加0.984Da，通常需要在肽图层面上进一步确认。
(A)
(B)
图3. iCIEF-MS分析bevacizumab。
(A), TIC-MS与iCIEF-MS谱图对比。
(B), 经iCIEF分离后的bevacizumab电荷变异体质谱数据解卷积结果。
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表3. iCIEF-MS鉴定到的bevacizumab电荷变异体
iCIEF-MS分析pembrolizumab
下图4及图5展示了我们使用iCIEF-MS直连技术分析pembrolizumab电荷变异体的结果，可见即使是pI仅差0.02的碱峰B1和主峰，也可以在iCIEF上得到基线分离(图4A)，随后的高分辨质谱分子量测定结果显示该碱峰与主峰相比，主要差异是其中一条重链的N端未发生焦谷氨酸环化（图5B-C）。另外观察原始质谱谱图不难发现，得益于Orbitrap高分辨质谱的灵敏度，即使是强度比主峰低2~3个数量级的碱峰B3，仍可得到糖型分布清晰的谱图，并可通过解卷积观察到该峰中各个组分的分子量，例如重链末端丢失GK(-185Da)的电荷变异体也在碱峰B3中被鉴定到（图5D）。表4展示了iCIEF-MS直连测得的每个峰中主要的电荷变异体种类。
(A) (B)
图4. (A), pembrolizumab iCIEF- UV 分离谱图。(B), pembrolizumab各个电荷变异体百分含量，上样量为柱上1.6μg。A1-A4, 酸峰; Main, 主峰; B1-B3, 碱峰。
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图5. iCIEF-MS分析pembrolizumab电荷变异体质谱图及解卷积谱图。
(A)，主峰与所有碱峰原始质谱图对比。
(B)，碱峰B1(pI=7.59)与主峰(pI=7.57)解卷积结果镜像图对比。
(C)，基于肽图得到的主峰和碱峰B1重链N端焦谷氨酸环化比率。
(D)，碱峰B3解卷积结果。
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表4 iCIEF-MS在线直联鉴定pembrolizumab电荷变异体。HC，重链。
iCIEF-MS分析ADC
ADC是一类经过细胞工程设计，将小分子药物通过linker分子偶联至mAb分子特定氨基酸位点上，通过mAb对细胞表面的靶点精确识别后，将小分子药物定向导入癌细胞中，以实现精准杀灭癌细胞，减少对正常细胞杀伤的一类蛋白质药物。由于小分子药物的偶联增加了产品的复杂性，故在质谱分析之前，通过各种分离技术对偶联了不同数目小分子药物的ADC进行预分离，可大大降低质谱数据的复杂度和解析难度。图6展示了iCIEF-UV分析ADC的谱图，可见由于偶联小分子药物的数目不同，ADC的电荷异质性也不同，可以在iCIEF层面上得到分离。图7展示了iCIEF-MS分析ADC的质谱谱图及解卷积结果，可见iCIEF将对偶联了不同数目小分子药物的ADC根据其电荷异质性进行分离后，能够减少质谱谱图中相邻信号之间的干扰，从而降低质谱谱图的复杂度，使质谱谱图的解析更精确和便利。
图6. iCIEF-UV 分析T-DM1谱图，上样量1.6μg。D0-D10, 小分子药物偶联数目。
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图7. iCIEF-MS分析T-DM1质谱谱图及解卷积结果（分离后未偶联小分子药物的组分，D0）。iCIEF分离大大降低了谱图复杂度。
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基于iCIEF分离的
蛋白电荷变异体离线馏分收集
iCIEF-MS可以从完整蛋白层面上提供蛋白电荷变异体的分子量信息，如需更多修饰位点层面的信息，可以对iCIEF分离的蛋白电荷变异体离线馏分收集后进行酶解，随后使用HPLC-MSMS进行肽图表征。图8展示了pembrolizumab蛋白电荷变异体离线馏分收集的iCIEF-UV谱图，更多详细信息可参考已发表文献[1]。
(A)
(B)
图8. Pembrolizumab 电荷变异体离线馏分收集及确认。
(A) 离线馏分收集。iCIEF-UV为10针平行进样的重叠，插入表格为每个峰以峰面积计算的相对含量和10针平行进样的CV。
(B) 峰纯度确认，每个峰均为5针平行进样，同一个pI收集峰的混合。
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在生物医药行业中，快速且准确的电荷变异体分析是关键需求之一。本文中使用的iCIEF在线直连高分辨质谱工作流程，能够克服CE-MS在灵敏度、重现性等方面的不足，特别是我们使用的CEInfinite平台可以灵活的在不同工作流程之间转换，实现蛋白质电荷变异体表征中的“一站整合式” iCIEF分析。
原文参考
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参考文献
[1] X. Zhang, T. Chen, V. Li, T. Bo, M. Du, T. Huang, Cutting-edge mass spectrometry strategy based on imaged capillary isoelectric focusing (iCIEF) technology for characterizing charge heterogeneity of monoclonal antibody, Analytical Biochemistry 660 (2023) 114961.
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