SCX-MS直联用于九种单抗的电荷异构体分析

单克隆抗体（简称单抗）具有选择性好、靶向性强、临床效果 好等特点。由于单抗具有的这些小分子药物难以匹敌的优势， 单抗受到研发者和医药市场的青睐。截止2022年7月，在中国 批准上市的国产单抗36个，进口单抗46个。国际上上市的单抗 超过110种，相比国际单抗种类，中国单抗市场还有较大增长 空间。 在单抗的发酵、纯化和存储过程中，因为酶或者非酶的条件， 导致单抗存在一系列翻译后修饰，例如糖基化、糖化、氧化、 脱酰胺和K丢失等。大量文献研究表明，这些翻译后修饰的不同 对单抗的安全性和有效性存在较大的影响。例如，随着糖化水 平的增加[1-4]，容易导致抗体表面正电荷减少，从而导致抗体 聚集体的增加。此外，糖化后的抗体也容易进一步反应，例如 羧甲基化，导致抗体颜色的变化[5]。又如，轻链N30的脱酰胺 造成赫赛汀轻微的效价丢失[6]，重链N55的脱酰胺造成该药物 效价的显著降低[7]。虽然没有报道表明K Loss的比例与抗体的 活性有直接关系，但K loss比例的不同会造成抗体药物批次一致 性的差异。 在这些翻译后修饰中，很多会导致抗体电荷的变化，即形成电 荷异构体。传统的的电荷异构体分离方法包括离子交换和电泳 法。两种方法分离机理不同，离子交换法根据抗体表面电荷的 不同进行分离，而电泳法如iCIEF根据抗体净电荷的不同进行 分离。定性酸碱组分，研究其来源有利于抗体工艺的优化。因 此，随着抗体行业的不断优化，对酸碱变异体的定性分析需求 日益增长。常规的离子交换法和iCIEF法都用UV作为检测器。但 UV检测器仅依靠保留时间定性，无法对没有对照品的组分进行 归属。由于常规离子交换法和iCIEF方法使用难挥发性的盐作为 流动相或者添加剂，造成这两种方法难以与MS兼容。如离子交 换法用氯化钠和磷酸盐作为流动相添加剂，iCIEF方法使用甲基 纤维素和尿素作为添加剂。发展MS兼容的电荷异构体分离方法 对抗体行业的生产技术优化和抗体质量研究有着重要的意义，因此，近年来各研究结构和研究人员开始关注该领域。 2018年，ThermoFisher的研究人员Ken Cook等发表了一种以 pH梯度为基础的SCX-MS方法，用于单抗的电荷异构体分析[8] 。为了方便中国读者研究和使用该方法，本文将这个方法的一 些细节进行分享，并将这个方法用于市场上销量最高的9种单抗 的电荷异构体分析，为抗体企业用户提供参考。