荧光应用介绍

“荧光共振能量转移”（Fluorescence Resonance Energy Transfer，简称FRET，有时也称为“福斯特共振能量转移”）是一种现象，其中一个处于“激发态”的供体荧光团分子通过非辐射过程将能量转移到一个合适的受体荧光团分子。这种能量转移被称为“非辐射”，因为它发生时不伴随供体荧光团发射光子。相反，它涉及当供体分子的荧光发射光谱与受体荧光团的激发光谱重叠时，处于激发态的供体分子直接转移能量。受体发出的FRET信号通常被称为“敏化发射”。

FRET只有在满足几个条件时才会发生在供体和受体分子之间。首先，分子必须足够接近——通常<10nm，但更常见的是，要成功展示FRET需要更近的位置。这是FRET的一个特性，使其成为如此强大的工具，因为分子之间的如此接近通常是两个分子相互作用的证据。FRET信号是这种近距离物理关系的直接经验证据，独立于成像系统的分辨率和传统的共定位技术。福斯特距离是指能量转移效率为50%的距离——通常在4-7nm之间，具体取决于特定的供体/受体对，通常用来表征荧光团对的潜在用途。随着分子变得更近，能量转移效率呈指数增长，并对分离距离极为敏感。

其次，如上所述，受体的激发光谱必须与供体的发射光谱重叠。更大的光谱重叠通常会导致更大的FRET可能性，但也使得数据校正/分析复杂化，因为这增加了由于供体激发波长直接激发受体分子而导致的假阳性FRET的可能性。

第三，供体和受体分子的偶极子必须有利于FRET的发生而取向。分子不仅要足够接近，而且偶极子必须足够对齐。在大多数情况下，这个条件是在大量分子中随机满足的，并且在大多数FRET计算中使用偶极取向的标准值。

FRET是一种成像技术，通过适当选择滤光片可以大大受益。在宽场成像应用中，应尽可能选择供体激发滤光片以避免直接激发受体分子。虽然不可能完全避免直接激发受体荧光团，但精心挑选的激发器将最好地利用供体和受体的激发光谱之间的差异。对于涉及激光激发的应用，例如共聚焦和TIRF成像，应使用最合适的激光波长，并配备适当的激光清洁滤光片。

同样，应选择最佳的发射滤光片以最好地区分供体/受体发射光谱。例如，在某些情况下，可能最好是将受体带通红移以最小化供体荧光发射的检测，而在其他情况下，这可能会过多限制受体发射的检测，从而适得其反。

多光子激发显微镜和FLIM（荧光寿命成像显微镜）是其他常用于FRET成像的激光技术，每种技术都有其自身的优势和劣势。

最后，FRET是一种涉及大量图像处理和图像校正的计算密集型技术。它绝不是一项简单的技术，最好使用具有外部滤光轮的系统来执行，这些系统能够独立控制激发和发射波长，或者使用图像分割系统，在活细胞成像中同时获取供体和FRET信号。根据模型系统的动态，时间分辨率可能在FRET中至关重要。

全内反射荧光（显微镜）技术是为了限制背景荧光并提高结果图像中的信噪比（s/n）而发展起来的一种技术。在TIRF中，通过利用光在两种折射率不同的基底界面之外的样品内部非常有限的范围内产生消逝波（或场）的能力来实现这一点。实际操作中，这涉及到对与玻璃载片或组织培养室直接接触的样本进行成像。如果光的角度大于临界角，这种折射率不匹配将产生一个与光频率相同的场/波。换句话说，一个通常会在488nm吸收光的荧光分子可以被488nm激光（或其他单色光源）产生的电磁场所“激发”，该电磁场被较低折射率材料反射。由于这个场的强度会随着距离呈指数衰减，因此产生的荧光信号将在表面不到100纳米的范围内发生。这大大减少了z轴信号，从而显著提高了样本的s/n。当然，这意味着感兴趣的分子必须在消逝场的有限范围内。

TIRF已经在多个领域使用了相当长的时间。最初的显微工作是使用棱镜和光束导向装置将激光/光从上方引入倒置显微镜设计的样品中。最近，通过高数值孔径镜头的“透过镜头”显微镜系统的发展，使得这种应用对于不想校准系统或担心激光在房间内乱射的研究人员来说更加易用。

然而，“透过镜头”方法对TIRF的滤光片/光学器件增加了额外的负担，因为反射光束被物镜收集并沿着光束路径向后传播。这意味着发射/阻挡光学器件不仅要处理大量的激发能量，而且由于散射和反射，这些光可能以高角度出现。典型的激光发射滤光片必须阻挡激发波长达到OD 6，但在TIRF中，大多数应用中这种阻挡必须超过OD 8（注意，许多现代光谱仪甚至无法在整个可见光谱中测量到OD 8）。我们的解决方案是使用专有的阻挡机制和光学器件来达到OD 8，即使在这些系统的高角度也是如此。

除了增加的阻挡要求外，这些应用中的二向色镜必须在反射波前特性和平整度方面极其稳定。标准激光扫描共聚焦可能只需要反射波前畸变（RWD）小于每英寸2波浪，而TIRF应用需要反射表面的畸变小于½波。这种反射波前的需求是在基底涂层之后，因为涂层过程总是对熔融石英基底施加扭矩应力。这使得对于某些涂层技术和某些基底的物理要求来说，生产满足这些平整度要求的二向色镜几乎是不可能的。

我们发现，使用改进的磁控溅射涂布机，结合专有的应力释放方法，并从2-3mm厚的基底开始，其平整度为1/10波，我们可以将RWD控制在1/2波。然而，我们还必须为这些商用TIRF显微镜设计并生产我们自己的立方体/支架/固定器（专利申请中），因为标准的显微镜立方体无法固定这些更厚的基底，并且不具备调整使TIRF应用更有效的二向色角度的能力。

由于独特的光圈排列，共聚焦显微镜在探测器上提供的图像是样本的一个薄光学切片或截面。例如，一个可能有几毫米厚的样本可以被减少到z轴上不到一微米的焦点场。

共聚焦中的照明场被一个光圈限制，通常称为针孔。视场也被一个针孔限制，该针孔放置在与照明点和第一个光圈共轭的像平面上。这种“共聚焦”配置导致到达探测器的离焦光线减少，通过大大减小成像体积来提高信噪比。

共聚焦显微镜最初由马文·明斯基（Marvin Minsky）开发，并在1957年的专利中描述，该专利使用了一个在照明光束内移动的舞台。来自样本的调制光被发送到一个光电管，用于与示波器一起查看。通过移动舞台，逐点完成照明和随后的检测。明斯基的高度原创性想法最终将彻底改变显微镜技术。

尽管明斯基的专利获得了批准，但仍存在几个技术难题。由于受限的光圈，他的系统需要一个非常强烈的光源。当时还不存在激光器，也没有其他足够强烈的光源用于荧光，考虑到针孔造成的损失。虽然明斯基使用了长余辉示波器进行查看，但当时没有办法忠实地记录图像。直到其他发明家和进一步发展，这种特殊的显微镜才对普通研究者有用。

强烈单色光源——激光器的发展解决了照明问题。配备数字化板的计算机使得记录和显示图像变得轻而易举。如今，现代扫描共聚焦使用一个或多个激光器作为照明源。扫描现在由精心控制的电流镜完成，这些电流镜以类似电视机的方式，由计算机控制，将衍射极限斑点在视场上以光栅运动移动。来自样本的散射反射荧光被发送到光电倍增管（PMT），而图像则逐点（像素）形成在计算机屏幕上。

尽管明斯基列出了共聚焦的许多优势，但或许最重要的特性是扫描共聚焦显微镜能够对样本进行光学切片。历史上，要获得细胞或组织最精细的细节，需要固定组织，然后小心地将其切成非常薄的切片进行观察或成像。这个过程需要杀死样本，并且可能需要研究者花费数年时间才能完善切割足够薄的切片进行成像的显微切片技术。

共聚焦的光学切片特性允许用户在没有显微切片技能的情况下成像厚组织。它还允许用户以非常高的分辨率成像活细胞、组织和生物体。因此，活细胞成像已成为共聚焦显微镜的一个重要子集。

这种光学切片能力也意味着可以在计算机中保存单个切片/图像，然后重建以显示样本的三维肖像。这是现在可用的激光扫描系统的一个非常重要的特性。

这个系统确实对用于荧光成像的光学元件提出了一些不寻常的要求。一个主要的误解是，特定激光器输出的激光光只产生一种波长。实际上，几乎所有激光器都会产生谐波和/或其他波长的散射。尽管这些次要线条与主线条相比强度可能非常弱，但它们仍然可以大大降低信噪比。如果荧光发射恰好与激光器的谐波（或其他噪声）处于同一波长区域，荧光信号可能会被完全掩盖，使其无法看见。

光束路径中的第一个元件是激光清洁滤光片，这是一种改进的激发滤光片。由于激光光的准直、相干特性以及光束相对较小的尺寸，这种光学元件应该经过研磨和抛光。这与宽场显微镜形成对比，后者不需要抛光和研磨。清洁光学元件还应具有非常好的透射特性，包括波前畸变小于每英寸一个波。楔形（光学元件外表面的完美平行度偏差）应最小化至小于一分钟弧，以便在同一系统中使用不同的清洁滤光片时无需重新对准。

清洁滤光片通常在全宽半最大值（FWHM）处为10nm。它阻挡来自激光源的所有其他光（最大范围从紫外到1200nm），并涂有抗反射（AR）涂层以实现最大透射。随着现在可用的更强大的新型激光器，AR涂层可能不再需要传输效率。然而，这些光学元件采用具有最大反射特性的干涉层制造，以避免热损伤，因此AR涂层将减少表面反射。这些反射绝不应被允许反射回激光腔本身。因此，这些光学元件设计成以3.5到5度的入射角（AOI）使用。二极管激光器在预热时发射波长会略有偏移，因此我们推荐使用20-25nm宽的清洁滤光片。

共聚焦中的二向色/二色分光器选择了更高的平整度规格，以改善与落射荧光照明系统相比的波前畸变。两者通常规定优于每英寸一个波，但某些激光系统可能需要更好的特性。

对于透射波前规格的需求也在增加，这通常要求更厚的基底。目前，将二向色镜制作在4-6mm厚的熔融石英基底上并不罕见。

随着激光器在过去几年中尺寸显著增大，人们也担心这种增加的功率负载可能会破坏主镜。在设计良好的二向色光学元件中，这不是问题，至少在常见光束尺寸下，功率可达8-10瓦特。镜子都涂有AR涂层，以最小化光束斑点反射并最大化透射。

偏振也是关于镜子的另一个考虑因素。由于所有与光束路径成角度的光学元件都可以作为偏振器，这在考虑到大多数激光源本身是偏振的情况下变得尤为重要。

与所有荧光一样，发射滤光片的主要职责是阻挡激发源。在共聚焦系统中，与落射荧光相比，这种阻挡通常不涉及光谱的如此广泛区域。然而，由于激光线的功率输出，阻挡可能必须特别设计为在特定激光发射波长处更高（可能超过OD 8）。

共聚焦的发射滤光片的实际设计仍有些争议。由于探测器通常是PMT，其中图像是逐像素（图像元素）形成的，这些发射滤光片光学元件不一定必须经过研磨和抛光。然而，由于对共聚焦图像的提高分辨率标准，大多数人认为像普通发射滤光片一样的研磨和抛光并非徒劳。最近有一些证据表明，具有大楔形（光束偏转）的发射滤光片可能会导致形态测量的不准确性，这可能会因为长的发射光束路径而加剧。

激光系统的滤光片组是围绕激光发射线构建的，而不一定是围绕特定荧光染料的最大吸收/激发。这确实提出了关于哪些荧光染料适用于特定激光系统的几个问题。幸运的是，现在荧光染料制造商提供了更多的选择。还可以选择使用多色初级镜，它会反射多个激光线，以便于操作或提高速度。