PCR 引物的建议Tm通常介于 55-70℃ 范围内，退火温度通常比Tm值低5℃ 。由于引物序列、长度和组成存在差异，因此，不同的引物通常很难具有相似的解链温度（Tm）。在这种情况下，具有较高 Tm 的引物可能会非特异性结合靶标，而具有较低 Tm 的引物难以与模板结合（图 1）。这将大大降低 PCR 的产量和特异性，甚至导致 PCR 实验失败。

图 1. 在未优化的情况下，引物在 60℃ 下结合不佳。Tm > 60°C 的引物可能会结合非靶标序列，而 Tm < 60°C 的引物只能部分结合或无法结合靶标。

为了成功进行 PCR 以获得最大产量和特异性，应对每个引物对的退火温度进行优化（图 2）。但优化过程可能漫长而繁琐，尤其当使用不同的引物组扩增多个 DNA 靶标时。

图 2. 基于退火温度进行 PCR 优化。在梯度PCR仪上以 2 ℃ 的增量设置梯度温度，优化退火温度。在本例中，最佳退火温度为 56℃。

如何克服 PCR 退火相关的挑战？

为了减少PCR优化，赛默飞开发出一种含共稳定组分的PCR缓冲液，可增强退火过程中引物-模板复合物的稳定性。

图 3. 使用含共稳定组分的缓冲液（使用 60℃ 通用退火温度），引物与模板的结合示意图。即使引物的 Tm 与 60℃ 通用退火温度不同，该共稳定组分也可以使引物与 DNA 模板发生特异性结合。

图 4. 使用 60℃ 通用退火温度进行高特异性和高产率 PCR 扩增。使用 Platinum SuperFi II DNA 聚合酶和一系列具有不同退火温度的引物组，以 60℃ 的通用退火温度扩增人基因组 DNA 中的 12 个靶标。所述退火温度使用 Tm 计算器计算。分子量标准 (M）：Invitrogen TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder。

使用通用退火温度还能带来什么优势？

通用退火温度的创新特性还可实现同时扩增不同长度的扩增子。通常，不同长度靶标的扩增需要不同的延伸时间，过长的延伸时间通常会导致非特异性扩增。但是，通用退火缓冲液中的共稳定组分可为引物-模板结合体提供稳定性。从而可以按照最长片段的延伸时间来扩增不同长度的片段，同时不影响特异性（图 5）。

图 5. 通用退火功能可实现短片段和长片段的同时扩增。使用 Platinum II Taq 热启动 DNA 聚合酶（具有通用退火特性）和另一种热启动 DNA 聚合酶（不具有通用退火特性）从人基因组 DNA 中扩增出四个不同长度的靶标。所有四个靶标使用同一 PCR 方案。所用分子量标准：Thermo Scientific ZipRuler Express DNA Ladder 2。

如此一来，使用通用退火温度，可使用同一扩增方案同时进行不同 PCR 片段的扩增（图 6），而无需单独进行扩增。这有助于节省大量时间并简化 PCR 方案，尤其当需要使用不同的引物组扩增多个序列时。

图 6. 通过同时扩增和通用方案节省时间。由于引物退火温度和延伸步骤不同，常规方案中的 PCR 检测需要通过顺序运行来扩增不同长度的靶标。借助具有通用退火特性的 Platinum DNA 聚合酶，可以使用通用方案在引物退火温度（60℃）和按最长片段计算的延伸时间下，同时完成不同的 PCR 检测。

有哪些 PCR 酶可以使用 60℃ 通用退火温度？

2023年12月31日前，Platinum SuperFi II 高保真 DNA 聚合酶持续特价优惠中：

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