当您使用比较Ct方法进行相对定量时，表达水平的差异被测定为测试基因的ΔCt与内源性对照品之间的差异。为了使该计算有效，内源性对照基因必须在所有研究的样本、处理或时间点稳定表达，以提供可靠的比较基础。为了找到最佳的内源性对照品，我们需要确定一个基因，其表达在您的特定实验条件下没有变化。在实践中，表达不变的情况很少见，因此，如果具有内源性对照基因的样品的Ct变化不超过0.5，则认为其表达稳定。
请记住，一个周期的差异相当于初始模板差异的两倍。对于ΔCt值在两个周期范围内变化的对照品，其表达水平将存在近四倍的差异。如果我们对一个表达在样本之间相差两倍或四倍的归一化基因进行分析，那么最终的计算将出现相同因子的误差。由于无法预测特定治疗或疾病状态将如何影响基因表达，因此确定正确对照品的唯一方法就是直接对样品进行qPCR运行。您需要选择一些候选基因并检查其表达。以下是一些简单的步骤。
首先，鉴定候选内源性控制基因。方法包括查看文献（如我们的应用说明），或者直接使用Applied Biosystems TaqMan内源性对照品检测选择工具来测试常见的对照品。您需要测试至少一个对照基因，但测试两到三个候选基因对找到给出最佳结果的基因会很有帮助。如果我们的文献搜索结果为空，那么就必须做一个测试，例如使用内源性对照品面板来筛选样本。这些面板由16至32个最常研究的候选基因组成，可以快速有效地测试多个样本。幸运的是，ACTB和HPRT看起来是很好的候选品，因为它们之前在类似的实验中使用过。很好，现在我们已经确定了两个内源性对照基因，我们可以验证候选基因了。
我们的下一步是使用相同的方法纯化所有样品的RNA。确保包括可能受治疗或时间过程影响的样本。因此，您可以比较不同治疗的内源性对照品情况。第三，定量并使用来自每个样品的等量RNA。由于您将验证对照基因，因此保持模板和试剂体积的一致性至关重要。接下来，通过qPCR反应测试候选内源性对照基因，每次反应都使用相同体积的cDNA。最后，比较每个候选内源性对照基因的样本间ΔCT。最佳对照品的ΔΔCT值最接近零，这意味着样品之间的表达没有差异。
使用Applied Biosystems实时荧光定量PCR仪器时，您可以让分析软件进行ΔCt计算。相对定量软件（如Applied Biosystems ExpressionSuite和DataAssist）可以通过QC图完成此操作。该软件将对候选对照品进行评分，最低分表示最合适的对照品。就是这样，我们完成了。在确定要使用的最佳内源性对照基因后，您就可以继续进行基因表达研究了。
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