单细胞蛋白质组揭示肌萎缩侧索硬化症蛋白动力学

肌萎缩侧索硬化症（ALS）俗称渐冻症，是一种神经退行性疾病，其特征是由于大脑和脊髓的运动神经元（MN）死亡导致进行性、无痛性肌无力。大量证据表明，TAR DNA结合蛋白(TDP-43)在多种MN疾病中存在病理变化。目前已获批的ALS药物治疗效果不大或仅限于特定的遗传亚群，由于缺乏特异性MN病理的生物标志物，严重阻碍了临床研究药物的开发。

2024年1月5日，美国杨百翰大学Ryan T. Kelly教授团队在Cell Reports杂志在线发表了题为“TDP-43-stratified single-cell proteomics of postmortem human spinal motor neurons reveals protein dynamics in amyotrophic lateral sclerosis”的论文。该研究利用单细胞蛋白组分析了对照和死亡后ALS组织中提取的MNs蛋白质表达的变化，解决了传统大块组织蛋白组学研究的局限性，并报道了有或无明显TDP-43病理学的ALS MNs中发现的差异蛋白存在广泛重叠，表明ALS中氧化磷酸化、mRNA剪接、翻译和囊泡运输的早期持续失调。

文章题目：TDP-43-stratified single-cell proteomics of postmortem human spinal motor neurons reveals protein dynamics in amyotrophic lateral sclerosis

发表期刊：Cell Reports

影响因子：8.8

发表时间：2024年1月

研究策略

样本类型：ALS (n = 8)和对照组CTL (n = 6)胸腰段脊髓组织

研究手段：单细胞蛋白组学

验证策略：原位杂交技术、免疫组化染色

研究结果

结果一：ALS中MNs单细胞蛋白质组特征分析

研究人员比较了ALS和CTL中MNs的蛋白丰度，平均单个MN样本定量890个蛋白质，降维聚类分析可以很好区分ALS和CTL（图1A-B）。其中ALS MNs中发现了298个高可信度的显著差异蛋白（DAPs）（图1C），进一步将潜在协变量（年龄、性别、死后时间间隔）纳入模型分析，筛选出7个DAPs支持细胞呼吸、mRNA剪接、转运和翻译相关通路失调（图1D-E）。为了研究DAPs之间的功能关系，作者构建了蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，并报道了一些蛋白复合物在细胞代谢、RNA加工和蛋白质稳态中起着重要作用，包括核糖体蛋白和延伸因子丰度减少（图1E）。

图1：ALS运动神经元的单细胞蛋白质组学分析

结果二：MNs中单细胞蛋白组检测的动态范围评估

通过比较MNs中蛋白强度，发现蛋白分布从高丰度神经丝蛋白（NfPs；NEFH，NEFM，NEFL）到低丰度膜相关突触蛋白（LIN7C）。有趣的是，尽管GFAP是一种已知的星形细胞蛋白，但在ALS和CTL MNs中都是最容易被检测到的蛋白。很大程度上ALS和CTL MNs蛋白质相对排名顺序是平行对应的，但一些丰度低的蛋白质，如Stathmin-2（STMN2）仅在CTL中检测到（图2A）。分析单细胞蛋白组数据中ALS组和CTL组共有及独有蛋白情况，其中CTL中有127个独有蛋白，ALS中有140个独有蛋白（图2B-C）。基因本体论（GO）和通路分析特有蛋白集发现，CTL中的RNA加工/剪接相关蛋白和ALS中的先天免疫信号成分显著富集，TDP-43 PPIs显示在特有的CTL蛋白集中互作蛋白更多，而在ALS特有蛋白集中不显著（图2C-D）。

图2：ALS MNs中缺乏STMN2蛋白同时STMN2 RNA的丰度降低

STMN2是已报道的TDP-43靶点，在人ALS MNs中异常剪接，因此大多数ALS患者的脊髓中STMN2蛋白是减少的。研究人员进一步评估ALS MNs队列中STMN2的表达和剪接是否发生改变，利用原位杂交检测了STMN2 RNA，显示ALS中STMN2 RNA水平显著低于CTL MNs组，与质谱检测结果相一致（图2E-F）。

结果三：TDP-43+NCIs MNS分层进行伪纵向研究

TDP-43在神经元胞质内错误定位和异常聚集形成神经元胞质包涵体（NCIs），为了验证神经退行性变早期和晚期的MNs可能表现出不同的蛋白质组学谱，研究人员进一步对CTL、NON（无明显TDP-43 + NCIs）、MLD:（轻度TDP-43 + NCIs）、MOD（中度TDP-43 + NCIs）、SEV（重度TDP-43 + NCIs）组中MNs进行单细胞蛋白组学分析，观察到在ALS MNs中STMN2的检测频率逐渐降低，表明错误剪接和STMN2翻译的减少是与TDP-43+NCIs积累相关的早期事件（图3A-B）。其中不同的ALS MNs组与CTL MNs组差异分析显示有大量的DAPs重叠，这表明ALS MNs中观察到的与氧化磷酸化、mRNA剪接、翻译和内溶酶体转运相关的蛋白缺失在TDP-43包涵体中持续存在（图3C-F）。

图3：伪纵向评估死后组织TDP-43+NCIs MNs层中蛋白质动力学

CNTNAP2蛋白在神经元中富集表达，相关性分析显示与TDP-43+NCIs的增加呈正相关。值得注意的是，CNTNAP2胞外结构域多肽已在来自ALS和额颞叶变性患者的脑脊液中检测到。

研究结论

该研究分析了来自死后ALS供体脊髓的单个MNs的单细胞蛋白质组学研究，并对TDP-43神经病理学进行MNs分层，发现在缺乏TDP-43+NCIs的MNs中观察到类似的DAPs，表明细胞能量和蛋白质稳态机制的损伤在包涵体形成的早期发生。报道了随着TDP-43+NCIs的增加逆转录复合体的表达下降，并提出逆转录复合体介导的内吞酶体分选作为未来ALS MNs中TDP-43包涵体形成或清除机制研究的一个潜在点。该研究凸显了单细胞蛋白质组学在增强人类神经系统疾病的研究方面的潜力。

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