Cell子刊 | 单细胞蛋白组学揭示胃癌腹水中肿瘤微环境形成机制

胃癌（GC）是全球第五大常见癌症，根据Lauran分类GCs分为肠型GCs（IGCs）和弥散型GCs（DGCs）两个亚型。恶性腹水积聚常见于伴腹膜播散的DGCs患者。尽管包括免疫检查点抑制剂在内的新型治疗方案已被开发并批准用于晚期胃癌，但腹膜播散性胃癌患者的缓解率仍然有限，腹水中肿瘤微环境是如何形成的尚不清楚。

2024年1月，日本熊本大学医学研究生院团队在期刊Cell Reports（IF=8.8）发表题为《Mesothelial cells with mesenchymal features enhance peritoneal dissemination by forming a protumorigenic microenvironment》的研究论文，该研究通过单细胞蛋白质组学和单细胞转录组分析，以全面表征恶性腹水的异质性细胞群和细胞外成分，揭示腹水中非恶性细胞形成促肿瘤微环境的潜在分子机制。

文章题目：Mesothelial cells with mesenchymal features enhance peritoneal dissemination by forming a protumorigenic microenvironment

发表期刊：Cell Reports

影响因子：8.8

发表时间：2024年1月

发表单位：熊本大学医学研究生院

研究策略

样本类型： 胃癌患者腹水（恶性腹水）、肝硬化患者腹水（非恶性腹水）

研究手段：单细胞蛋白组、单细胞转录组、免疫组化、ELISA、siRNAs转染

研究结果

结果一：蛋白组学分析确定了免疫效应器的缺陷和CD45(-)/EpCAM(-)细胞在恶性腹水中频繁存在

使用单细胞质谱CyTOF技术，对来自30例腹膜播散的GC患者和10例肝硬化患者腹水进行细胞群聚集分析，用于研究恶性腹水的特点。在恶性腹水中，主要检测到了上皮细胞粘附分子(EpCAM)+的癌细胞，但在这些癌细胞中，还发现了多种非癌细胞（图1A, 1B）。在这些非癌细胞中，CD163+的巨噬细胞在CD45+造血细胞中的比例在恶性腹水中明显高于非恶性腹水。恶性腹水中的癌细胞数量与CD163+巨噬细胞数量呈正相关（图1E, 1F），这表明巨噬细胞可能对癌细胞的生长有促进作用。与非恶性腹水相比，恶性腹水中CD8+ T细胞的程序性死亡受体1（PD-1）表达显著增加，表明在恶性腹水中，T细胞的免疫监视功能可能受损。在非癌细胞中，有一部分是CD45(-)/EpCAM(-)的细胞，这一部分在恶性腹水中的比例显著高于非恶性腹水。CD45(-)/EpCAM(-)的细胞富含了大量的间充质和间皮细胞标记物，并且与癌细胞相比，它们保持了较高的角蛋白表达，这表明这些细胞可能来源于间皮细胞。通过对来自20例胃癌患者腹膜转移样本进行单细胞RNA测序，进一步验证了CD45(-)/EpCAM(-)的细胞主要来源于间皮细胞。

图1 肿瘤免疫监测减弱，恶性腹水中 CD45(-)/EpCAM(-)细胞频繁出现

结果二：CD45(-)/EpCAM(-)细胞群中具有间充质特征的间皮细胞在恶性腹水中表现出分泌表型

间皮-间充质转化（MMT）诱导的间皮细胞与癌细胞相互作用，被认为是腹膜转移中癌症相关成纤维细胞的一个亚群。MMT诱导剂处理的间皮细胞在免疫荧光（IF）分析中显示成纤维形态，细胞角蛋白表达减少，α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）表达增加（图2A）。使用间皮细胞和MMT诱导的间皮细胞进行质谱细胞术分析，发现分离的细胞含有两个不同的间皮细胞簇和很少的CD31内皮细胞(图2C, 2D)。研究发现，间皮细胞簇-2由MMT诱导间皮细胞组成，在恶性腹水中具有间充质特征（CD45(-)/EpCAM(-)细胞聚集在GC患者的恶性腹水中）。

图2 MMT诱导的GC腹水间皮细胞分泌表型

结果三：具有间质特征的间皮细胞与恶性腹水的IMCs有显著相关性

通过对间皮细胞和MMT诱导的间皮细胞进行RNA测序，发现MMT诱导的间皮细胞在基因表达上发生了全面的变化。炎症因子IL-1b可以促进趋化因子的表达，而TGF-b1可以增强这种诱导效果。在恶性腹水中，MMT诱导因子（包括IL-1b和TGF-b1）的浓度在胃癌患者中显著高于肺癌患者。表明，MMT诱导因子主要来源是癌细胞。在恶性腹水中，CXCL1、CXCL5、CXCL8、CCL2、CCL5和VEGF等趋化因子的浓度在GC患者中显著高于LC患者。

通过使用来自9名肝癌（LC）和15名胃癌（GC）患者的恶性腹水进行大规模细胞分析，免疫细胞主要分为淋巴细胞（CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、NK细胞和B细胞）和CD11b+髓样细胞。髓样细胞被进一步细分为两个粒细胞簇（CD66b+簇1和簇2）和三个单核细胞簇（CD14+簇1、簇2和簇3）。其中，CD66b+簇2和CD14+簇1在恶性腹水中占主导地位。CD66b+簇2表现出比CD66b+簇1更高的arginase-1和TGF-b1表达，这表明CD66b+簇2具有MDSCs的特征。在CD14+单核细胞簇中，CD14+簇1表现出比其他两个簇更高的iNOS、TGFb1、CD163和CD206表达，这表明TAMs在CD14+簇1中富集。在恶性腹水中，GC患者的CD66b+簇2和CD14+簇1的百分比显著高于LC患者。通过相关性分析，发现具有间充质特征的腹膜细胞簇2与髓样细胞簇之间存在显著的相关性。这表明具有间充质特征的腹膜细胞可能是恶性腹水中免疫细胞分布的重要来源。

图3 有间质特征的间皮细胞与恶性腹水的IMCs有显著相关性

结果四：MMT诱导的间皮细胞的TNC与癌细胞上的SDC1具有密切相互作用

接下来，该研究使用间皮细胞和MMT诱导的间皮细胞的RNA测序数据进行了基因集富集分析（GSEA），通过IL-1β + TGF-β1处理， MMT诱导的间皮细胞中富集了细胞外基质（ECM）相关途径（图4A）。MMT 诱导促进了间皮细胞中ECM 蛋白（如胶原蛋白、纤维连接蛋白和 TNC）的基因表达（图 4B）。蛋白质组学分析同样显示，在GC患者的恶性腹水中，ECM糖蛋白和调节因子（如纤维连接蛋白、TNC和serpin 蛋白家族成员）作为细胞外成分富集（图4C）。

对IL-1β + TGF-β1处理的间皮细胞进行了长读长RNA直接测序，研究发现TNC亚型3主要在用IL-1β + TGF-β1处理的间皮细胞中表达。MMT诱导的间皮细胞中的TNC与癌细胞中的syndecan-1（SDC1）之间的相互作用显示出突出的贡献（图4G）。这些发现表明，MMT诱导的间皮细胞中具有间充质特征的TNC与癌细胞上的SDC1之间的相互作用在腹膜播散中起着重要作用。

图4 MMT诱导的间皮细胞的TCN与癌细胞上的SDC1具有密切相互作用

结果五：MMT诱导的间皮细胞衍生的TNC增强了漂浮癌细胞的附着和生长

使用正常培养基、GC患者的腹水、间皮细胞条件培养基（control-CM）或MMT诱导的间皮细胞（MMT-CM）进行球状体附着测定，以研究MMT诱导的间皮细胞TNC在腹膜播散中的重要性。结果发现， MMT诱导增强了肿瘤球状体在间皮细胞周围附着和扩散（图 5B，5C）。小干扰 RNA （siRNA）实验发现，MMT诱导的间皮细胞中TNC耗竭减少了GC球状体在间皮单层上的附着和扩散（图5D）。表明，TNC在GC细胞的附着和定植中起着至关重要的作用。腹膜肿瘤中存在细胞角蛋白/αSMA/钙视网膜蛋白三阳性间皮细胞，TNC在间皮细胞中特异性表达，表明TNC表达是由培养的间皮细胞中MMT诱导。

以上结果表明，来自MMT诱导的具有间充质特征的间皮细胞的TNC增强了GC细胞的附着和生长，从而产生了一种腹膜播散形式。

图5 MMT诱导的间皮细胞中TNC增强癌细胞的定植和生长

结果六：TNC在腹膜播散中起重要作用

为了进一步研究TNC在体内腹膜扩散中的作用，使用从K19-Wnt1 / C2mE转基因（GAN）小鼠中建立的小鼠GC细胞系（GAN-KP细胞）进行了腹膜播散模型实验。使用了Cdh1基因敲除的GAN-KP细胞（GAN-KPC细胞），发现在Cdh1敲除的GAN-KPC细胞中，E-cadherin蛋白的表达在膜上消失，同时维持了SDC1的表达。此外，这些细胞的形态学观察显示，它们对培养皿的附着力和细胞间的接触都减弱了（图6A）。当将GAN-KP或GAN-KPC细胞注射到小鼠的腹膜腔内时，与GAN-KP细胞相比，GAN-KPC细胞在腹膜内形成了更大的肿瘤，并导致了更严重的体重减轻和腹水积累。在TNC基因敲除的小鼠中，由GAN-KPC细胞形成的腹膜肿瘤明显小于在野生型小鼠中形成的肿瘤，体重减轻和腹水积累也受到抑制。这些结果与球状体附着实验的结果一致，表明TNC在GC细胞的附着和生长中起着重要作用。另外还建立了Sdc1基因敲除的GAN-KPC细胞（GAN-KPCS细胞），与GAN-KPC细胞相比，其在腹膜肿瘤形成中的效果显著降低。此外，当将GAN-KPCS细胞注射到Tnc-KO小鼠的腹膜腔内时，肿瘤几乎消失，体重也没有下降。Tnc-KO小鼠中形成的腹膜肿瘤不含TNC，而由GAN-KPCS细胞形成的肿瘤不表达SDC1。结果表明，TNC和SDC1之间的相互作用在腹膜肿瘤形成中起着关键作用。

图6  具有间充质特征的间皮细胞TNC在CG细胞腹膜播散中的重要作用

研究结论

本研究中，通过对单细胞蛋白组学技术，在胃癌腹水中发现免疫效应物的缺陷以及免疫抑制细胞的积累，并鉴定了CD45(-)/EpCAM(-)细胞的五个不同亚群。CD45(-)/EpCAM(-)细胞中具有间充质特征的间皮细胞是参与免疫抑制性骨髓细胞(IMC)募集的趋化因子的主要来源。此外，间皮-间充质转化(MMT)诱导的间皮细胞强烈表达细胞外基质(ECM)相关基因，包括tenascin-C (TNC)，增强转移定植。这些发现强调了间充质细胞群在促进腹膜传播的致瘤性微环境发展中的明确作用。

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