利用CD-PHH 3D肝脏模型进行肝药酶诱导药物的筛选及机制研究

细胞色素P450 （CYP）3A4酶的诱导是药物间相互作用（DDI）的重要原因。因此，识别药物是否诱导CYP3A4成为药物成功研发的先决条件。

在该篇文章中，作者证明了化学定义培养条件下的人源原代肝细胞（CD-PHH）3D模型是筛选CYP3A4诱导药物的有力工具。在对25个药物（12个已知CYP3A4诱导剂和13个阴性对照）以生理水平相关浓度暴露的测试中，CD-PHH 3D模型对CYP3A4诱导药物的识别达到100%的灵敏度和100%的特异性。三种CYP3A4诱导剂在CD-PHH 3D模型中体现出对比2D单层培养模型高出数倍的诱导能力。

其中，作者发现了一种莫洛尼鼠白血病病毒前病毒整合位点（PIM）激酶抑制剂AZD1208，在其研发在临床一期因意外的CYP3A4诱导而终止的背景下，只在CD-PHH 3D模型而非2D单层培养模型上出现CYP3A4诱导。基因敲低实验发现AZD1208是通过孕烷受体（PXR）来实现CYP3A4的诱导。另外，典型诱导剂利福平仅通过PXR来诱导CYP3A4和CYP2B6，而苯巴比妥对CYP酶对这两种酶的诱导没有表现出对PXR或者雄烷受体（CAR）的激活绝对依赖性。机制研究进一步发现，AZD1208对CYP3A4的诱导涉及丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶（MAPK/ERK）通路，且仅在3D培养模型中诱导。同样，作者发现表皮生长因子受体/人表皮生长因子受体2（EGFR/HER2）双抑制剂拉帕替尼只在CD-PHH 3D模型中诱导CYP3A4。这些发现证明了CD-PHH 3D模型在筛选CYP3A4诱导药物以及探究诱导机制方面的巨大价值。

1. CD-PHH 3D模型能够在临床相关浓度下预测药物的CYP3A4诱导能力

作者首先测试了24个药物在CD-PHH 3D模型上的诱导能力，其中11个药物有明确证据证明其在人体内能显著诱导CYP3A4，另外13个药物没有任何对CYP3A4诱导的报道。经过72小时在临床相关浓度（等于或低于Cmax）下的药物暴露，以检测CYP3A4 mRNA表达为终点，作者发现典型诱导剂利福平的诱导效应最为明显，其相较于空白组能够引起几乎5倍的CYP3A4诱导。同时，该诱导幅度与之前报道的人体内利福平的诱导结果也非常相似。根据FDA和EMA推荐的诱导判断标准（即定义两倍以上的表达增加为诱导），全部13个阴性药物在CD-PHH 3D模型上均未检测出CYP3A4诱导（图1）。

图1

接下来，作者利用相同供体来源的细胞构建了传统2D单层培养模型在相同的条件下进行诱导实验，并观察到了阳性药物在2D模型上较3D模型极为巨大的诱导差异（图2）。

图2

以药物审批管理机构认可的典型诱导药物利福平为例，其在2D模型上的诱导量为空白组的35倍，远高于体内以及3D模型的5倍诱导量。在以利福平为诱导基准的情况下，3D模型显示阳性药物的诱导量均一且在全部在25%以上，而在2D模型上的诱导量差别巨大。例如，苯巴比妥和丙磺舒在Cmax的暴露浓度下在3D模型上均有较利福平50%以上的诱导，而在2D模型上的诱导量低于20% （图3a）。根据FDA的判断方法，诱导阳性的药物应同时满足mRNA表达增加两倍以上和较阳性药物（利福平）20%以上的诱导两个条件。因此，CD-PHH 3D模型预测药物对CYP3A4的诱导能够达到100%的灵敏度和特异性，且优于传统的2D模型。作者进一步地研究了2D和3D模型上CYP3A4的基础表达以及在阳性药物暴露下的绝对诱导量，发现两种模型的巨大差异，由此可以解释两个模型诱导实验结果的差异和3D模型较2D模型在该应用上的巨大优势（图3b-c）。

图3

2. AZD1208仅在CD-PHH 3D模型而非2D模型上诱导CYP3A4

AZD1208是治疗急性髓系白血病的候选药物，且近期因临床上CYP3A4的诱导效应而终止研发。然而，在临床前利用人类肝脏细胞系或者不同捐赠者来源的原代肝细胞构建的2D单层培养模型均未能检测出AZD1208对CYP3A4的诱导。于是，作者测试了AZD1208在0.2xCmax（1uM）的暴露浓度下在CD-PHH 3D模型上对CYP3A4的诱导，并重复了其在2D模型在相同暴露条件下的诱导实验。结果表明，AZD1208在3D模型上有对CYP3A4较空白组3.5倍的诱导，并且诱导量非常近似利福平，而与之前报道的结果一致，其在2D模型上对CYP3A4的诱导量为空白组的两倍以下且远低于利福平的诱导量（图4a-c）。作者进一步测试了AZD1208暴露下CYP3A4的蛋白表达量以及对CYP3A4探针底物的代谢功能，证实了AZD1208仅在CD-PHH 3D模型上而非2D模型上能够引起CYP3A4的诱导，且该诱导为浓度依赖并在高浓度饱和（图4d-g）。作者还利用CD-PHH 3D模型证明了AZD1208对其他CYP酶的诱导作用。最后，作者在不同个体来源的CD-PHH 3D模型上检验CP3A4的诱导效果，发现在不同个体来源的细胞中均产生了诱导作用（图4h-i）。

图4

3. 诱导机制研究：AZD1208对CYP的诱导依赖于PXR

作者利用siRNA敲低调控CYP表达重要核受体PXR和CAR的表达。结果表明，AZD1208和利福平对CYP3A4和CYP2B6的诱导依赖于PXR，而苯巴比妥则未呈现出明确的核受体依赖（图5）。

图5

4. MAPK/ERK 信号通路参与AZD1208对CYP3A4的诱导 

作者进一步探索AZD1208作用于核受体激活上游的CD-PHH 3D模型特异的诱导机制。由于直接的核受体配体也能够在2D模型中被识别，作者于是假设AZD1208的CYP诱导效应来源于间接的3D模型特异途径，如翻译后修饰的磷酸化作用。结果显示，AZD1208能够抑制ERK1/2的磷酸化（图6a）。为了证明该作用与CYP酶的诱导相关，作者通过AZD1208和EGF（MAPK/ERK通路效应器）共同暴露的方法，发现EGF能够显著抑制CYP3A4的基础表达，而对CYP2B6不产生影响。共同暴露使AZD1208失去了对CYP3A4的诱导能力，而对CYP2B6的诱导没有影响 （图6b-c）。另外，作者发现EGFR/HER2双抑制剂拉帕替尼只在CD-PHH 3D模型中诱导CYP3A4，而在2D模型中的诱导几乎为0（图6d）。这些证据证明MAPK/ERK信号通路在3D模型中CYP3A4的诱导中扮演了重要作用（图6e）。该结论也从机制层面提供了CD-PHH 3D模型在药物相互作用研究中优于2D细胞的依据。

图6总结

该篇文章为CD-PHH 3D模型相较2D模型能够更好模拟和预测药物对CYP酶的诱导提供了重要依据。CD-PHH 3D模型不仅能够准确预测CYP酶诱导，而且可以应用于诱导机制的研究。由此，该模型为药物研发过程中的CYP酶诱导的筛选，特别是针对非常规诱导机制候选化合物的发现提供了优良的平台。

原文链接

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32320483/