iTRAQ/SILAC/SWATH/蛋白表达纯化

同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ)

iTRAQ (isobaric tags for relative and absolute quantitation）技术是由美国应用生物系统公司ABI 研发的一种多肽体外标记技术。iTRAQ 4标 或8标的同位素标记试剂由4种相对分子质量分别为114，115，116和117Da或8种相对分子质量分别为113 ，114 ，115，116，117，118，119 和121Da的报告基团（reporter group），相对分子质量分别为31~24Da的质量平衡基团（balance group）以及一个相同的肽反应标记试剂基 团（peptide reactive group）组成。不同的报告基团分别与相应的平衡基团相配后，相对分子质量均为145，即等量异位标签（isobaric tag）。

技术优势：

同时对2-8种不同条件样品进行蛋白质差异分析；

不会破坏所测定的蛋白质；

适合样品类型多：胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白等；

与凝胶分离的蛋白质定量技术相比，iTRAQ质谱定量技术可检测到更多类型的蛋白质分子，如低丰度蛋白质、强酸（碱）性蛋白质、<10KD 或 >100KD的蛋白质分子；高通量，可一次实验，实现多个样品的蛋白质定性定量；

标记完全，标记效率高达97%以上；

几乎兼容所有来源的样本；

定量敏感，反应速度快，实验周期短。

样本要求：

动物组织：黄豆粒大小，-80℃冰箱或者液氮保存，干冰运输；

细胞样本：细胞量大于10的7次方，-80℃冰箱或者液氮保存，干冰运输。

结果提供：

样本质质检报告；

实验原理、操作流程、试剂耗材、结果说明；

提供标准生物学分析。

SILAC标记定量蛋白质组学

SILAC 的是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经 5-6 个倍增周期后，稳定同位素的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定。

技术优势

· 该技术属于体内标记，标记效果稳定，细胞在传代6-8代之后，蛋白标记效率可达90%以上。其标记效率不受裂解液的影响，不仅适合与进行全细胞蛋白的分析，还适合膜蛋白的鉴定与定量。

· 标记是在样本处理前引入，随后进行蛋白质分离、酶切和鉴定，后续实验对样品的影响一致，故样品处理所带来的定量误差会很低。在检测极低水平的蛋白变化或翻译后修饰时，这一点特别有用。

· SILAC灵敏度高，样本量要求少，通常每个样品只需要几十微克的蛋白量。

· 采用质谱定量，定量结果准确且批次变异小，重复性好。

· 体内代谢标记与SDS-PAGE或色谱分离技术相结合，兼容疏水性蛋白和偏碱性蛋白，不受蛋白质限制。

SWATH技术检测

SWATH（Sequential Window Acquisition of all Theoretical fragment ions）是瑞士苏黎世联邦理工学院的 Ruedi Aebersold 博士及其团队与 AB-SCIEX 于 2012 年联合推出的一项全新的质谱采集模式技术。SWATH技术具有灵敏度高，重现性强，准确度高，高通量，线性动态范围大等优点。传统的质谱数据采集方式为数据依赖型（Data-dependent acquisition，DDA）采集方式也叫做 Shot-gun 法，在一级质谱扫描中，根据母离子的强度高低来选择母离子进行串联质谱的扫描，得到二级谱图在蛋白数据库进行搜索。这种扫描方式会丢失大量有用的谱图，同时重复性较差。

SWATH 采集模式是一种新型的 MS/MS 扫描技术，属于数据非依赖型采集方式（Data-independent acquisition，DIA）。DIA按照设定的方法，将所有的母离子都进行串联质谱扫描。SWATH 根据酶解肽段的质荷比和洗脱时间来设计采集二级谱图的离子窗口。以扫描范围 400～1200 为例，m/z 25 作为一个扫描间隔（SWATH），每个 SWATH 扫描时间设定为100ms，那么该扫描范围累计需要 32个扫描窗口，完成一次扫描仅需要 3.2秒。

SWATH流程图如图所示，分为以下几个步骤：

1）蛋白质的提取，酶解和纯化。

2）酶解后的肽段进行 shotgun检测，用 proteinpilot进行数据库检索，得到蛋白定性

3）根据 shotgun 的检测结果，确定 SWATH 的扫描间隔等质谱参数，进行样本的 SWATH检测，每个样本重复检测3次。

4） 用shotgun 的检索结果建立离子谱图库，SWATH样本检测到的谱图信息使用Peakview在离子库中进行蛋白的匹配和定量信息的提取。

5）将Peakview导出的蛋白结果导入到 Makerview进行数据处理，得到蛋白定量结果。

蛋白表达纯化

随着蛋白药物市场的快速发展和蛋白质组学研究的深入，高纯度活性蛋白的需求越来越大。威斯腾生物中心组建了一支由多名具深厚生物技术基础与制药企业工作经验的留学归国人员和国内专家为核心的团队。可为国内外客户提供从基因到蛋白纯化的整套技术服务。

威斯腾服务特色

稳定而多样的表达系统：威斯腾生物已建立整套的基因克隆与表达体系，无论是单个基因的克隆、表达与纯化，还是多个基因高通量的基因克隆、表达和纯化，均能选用适合您试验（科研项目）需要的表达系统和合适的表达载体为您提供优质的服务。

多种纯化方式：可为客户提供多种蛋白纯化服务，纯化方式包括亲和层析纯化、凝胶过滤、离子交换、疏水层析等，客户可根据需要选择合适的纯化方式。

专业的团队和良好的信息管理体系：专业的基因克隆、蛋白表达与纯化技术人员与团队，具有丰富的表达和纯化经验，可为客户解决各种瓶颈问题, 良好信息管理体系使我们能够为客户提供成熟、高效的基因克隆服务。

操作流程

大肠杆菌和酵母蛋白表达系统：

合成基因（另外收费）或者客户提供

SDS-PAGE检测表达

Western blot检测表达（可选）模板(cDNA、基因组DNA、质粒等)

构建表达载体

筛选阳性克隆

表达优化和可溶性分析

提供结果

１、构建的表达载体及测序报告

２、SDS-PAGE结果

３、筛选的表达菌株

４、Western blot结果

５、实验流程及结果

６、2ml 1.0×108pfu/ml的病毒（利用昆虫杆状病毒蛋白表达系统表达时）

稳定表达细胞株（哺乳动物细胞）

威斯腾实验服务流程

威斯腾生物服务项目

【本平台合作项目】 

分子生物学、细胞生物学、病理染色检测、细胞敲除&敲入、模式与转基因动物、SPF动物保种、免疫学检测、影像学检测、原代培养、细胞药筛、CRISPR/Cas9基因编辑、基因芯片、高通量测序、蛋白组学、代谢组学、高通量高内涵筛选、药效学评价、药理毒理学实验、慢病毒包装与稳转株建立、SiRNA与纳米载药、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务！