实时荧光定量PCR服务

活动内容：

（1）对于检测普通基因表达情况的样本，原价：300 元/样本，现价：200 元/样本

（2）引物合成，费用全免

（3）免费提供3次重复的实验结果。

（4）引物和探针设计免费。

（5）RNA抽提费用全免。

（6）免费提供RNA保护试剂，上门服务取样。

注：

1、此活动不能与其他活动同时参与；

2、样本数量必须大于 5，检测的基因数量不小于 3 个

3、此活动的最终解释权归威斯腾生物所有。

一、荧光定量PCR

荧光定量 PCR（也称 TaqMan PCR,以下简称 FQ-PCR）是美国 PE（Perkin Elmer）公司 1995 年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规 PCR 基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的，与传统PCR 相比，FQ-PCR 具有许多优点。与普通 PCR 相比，FQ-PCR 具有许多优点：1、封闭反应，无需 PCR 后处理。2、特异性强，灵敏度高。3、采用对数期分析，摒弃终点数据，定量准确。4、定量范围宽，可达到 10 个数量级。5、仪器在线式实时检测，结果直观，避免人为判断。6、可实现一管双检或多检。7、操作安全，缩短时间，提高效率。荧光定量 PCR 是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。

二、主要实验步骤如下：

 1、设计并合成 Realtime PCR 引物。 

 2. 引物溶解后使用 Promega 的 TaqDNA 聚合酶进行含 SG（SYBR®； Green）的 PCR 反应的优化。 

 3. 客户样品 RNA 抽提 。a.实验对象为组织样品，取适量（50-100 mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品加 1 ml 的 RNA 抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提 RNA。 b.实验对象为细胞样品，每份样品取 1×106～1×107 细胞，PBS 清洗细胞，去 PBS 加 1 ml 的 RNA 抽提试剂 Trizol（Invitrogen），裂解后抽提 RNA 。

 4. RNA 质量检测  a. 紫外吸收测定法测定 RNA 在分光光度计 260 nm 和 280 nm 处的吸收值，以计算其浓度并评估 RN A纯度 。b. 使用ambion公司的甲醛电泳试剂进行变性琼脂糖凝胶电泳，检测RNA纯度及完整性。 

 5. 使用逆转录酶（Promega）进行反应，将样品RNA逆转录为cDNA。 

 6. 制备标准曲线样品： 进行相对定量，需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增，其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。 

 7. 标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中，进行RealTime PCR扩增和检测。 

 8. 检测结果进行标准曲线分析：以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差，所得结果代表某样品的目的基因相对含量。 

 9. 提供实验报告：包括详细的实验方法及实时荧光定量 PCR 实验结果的相关图表 。

 三、荧光定量 PCR 中的一些术语

 CT值：荧光信号有统计意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数，或者说是从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数。

 阈值：阈值的默认设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。

 CT值与起始模板的量成线性关系。

 四、客户须知：

 1、请您提供新鲜的且尽量多的材料，或直接提供纯化好的总 RNA 或 DNA（大于 5 ug/样本）。如是如织：100－200 mg

 2、请通过 EMAIL 提供已知的全长基因序列。

 3、请提供详细背景资料：DNA/RNA 来源，丰度。

 五、结果提供：

 1、实验详细步骤，和相关数据。

 2、标准曲线，扩增曲线，溶解曲线。

 3、完整的实验报告（含软件分析结果）

威斯腾实验服务流程

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【本平台合作项目】 

分子生物学、细胞生物学、病理染色检测、细胞敲除&敲入、模式与转基因动物、SPF动物保种、免疫学检测、影像学检测、原代培养、细胞药筛、CRISPR/Cas9基因编辑、基因芯片、高通量测序、蛋白组学、代谢组学、高通量高内涵筛选、药效学评价、药理毒理学实验、慢病毒包装与稳转株建立、SiRNA与纳米载药、ChIP、CO-IP、生物信息学分析、知识产权服务！