基于Fluidigm BioMark系统的基因分型检测

伯豪生物Fluidigm Biomark™ HD SNP分型解决方案

一、 概述

单核苷酸多态性 ( single nucleotide polymorphisms,SNPs)主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。SNP作为一种常见的遗传标记，可用于遗传疾病基因的连锁定位、克隆和鉴定；复杂疾病的关联分析；肿瘤易感基因和热点突变的鉴定；精准医疗；种群进化、迁徙等研究方面有着重要作用。

对于SNP分型方法有很多，高通量的方法有测序、芯片等；中低通量的方法有定量PCR、引物延伸、溶解曲线等。本项目推荐采用Fluidigm公司的Biomark™ HD 系统进行SNP分型检测。Fluidigm高通量基因分析系统（Bio-Mark™），是集成了流体通路（Integrated Fluidic Circuit，IFC）技术、实时定量PCR技术及强大的基因分析软件的技术平台。IFC 将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，通过一个控制系统自动完成多达9216个PCR反应。大大降低了手工加样的步骤并减小了误差。IFC系统比传统的384孔板系统能少用99.5%的master mix 试剂却多产生出24倍的数据。

二、 Fluidigm SNPs的检测方法介绍

1. Fluidigm技术特点：

Biomark™ HD系统的核心技术就在于将实时定量技术集成了流体通路技术：利用集成电路制作工艺（光刻）在硅片或石英玻璃上刻有许多微管和微腔体，通过不同的控制阀门控制溶液在其中的流动来实现生物样品的分液、混合，并实现高效准确地实时PCR扩增、检测。

图1Biomark™ HD系统

Biomark™ HD系统配套的检测芯片有如下几种格式，满足不同SNP位点和样本数的研究需求，分别为12*12（12样本*12位点），48*48（48样本*48位点），96*96（96样本*96位点），192*24（192样本*24位点），不同格式检测芯片如图2。

图2不同格式检测芯片图示

Fluidigm的SNP检测技术与Taqman类似是基于终端荧光读取判断，每孔采用双色荧光检测一个样本的一个位点可能的两种基因型，不同的SNP模板对应不同的荧光产物。

(1) 准确度：Juno平台的实验原理与Taqman一样，是基于实时定量PCR的技术手段，基因分型的准确率>99%。[1]

(2) 特异性：Taqman探针，一般选用8-12bp长度在SNP位点两端设计，可能导致多个同源序列扩增，引起背景增高，杂交信号降低，KASP的引物为24-26bp，特异性更高，SNP call rate 会更高，达到99.9%。

(3) 成本低：纳升级的反应体系十分节省试剂；对于每一个特定位点单独合成的探针，KASP的非荧光标记的引物，保质期长，而Taqman的针对特定位点的探针是荧光标记的，保质期短，成本高，用不掉会浪费。而KASP荧光标记的Master mix为通用型消耗品，可根据实验用量酌情采购，不会浪费。

(4) 通量高：一次芯片最多可进行9216个反应。

(5) 灵活性：选择已有芯片或定制新芯片。任何种属的相应序列，经过预扩增验证后设计探针，有效提高低质量、低浓度或珍贵样本的分析结果。

2. SNP 检测样品要求：

对于人类基因组，建议最少10μl，浓度60ng/μl。对于大于人类基因组的其它物种的基因组，建议使用specific target amplification(STA)。

3. 实验流程：

从上样到拿到数据只需要3-4小时左右。

三、 常见SNP分型方法概述以及与Biomark HD平台比较

1. 一代测序（sanger sequencing）

优点：SNP分析金标准，既能发现已知SNP，也能发现未知SNP。

缺点：每个位点均需要经PCR扩增、跑胶，然后切胶纯化，再测序。流程相对复杂，成本较高，工作量大，周期长，不适合大样本多位点检测。同时，一代测序仅能检测频率高于20%的SNP位点。

2. SNaPshot

优势：类似LDR等多重引物单碱基延伸技术，可同时进行约10个位点PCR产物引物延伸，适合中低通量的SNP分型。

劣势：操作复杂，每个样品的每个位点都需要PCR预先扩增，跑胶，DNA纯化。对延伸引物要求极高，如每个引物有4-6个碱基差异，不能有互补区段，还要相同条件延伸，除厂家已经验证的少数位点外，很难自己设计针对新位点的检测。步骤分散，费时且易出错，准确性不高。

3. 焦磷酸测序（pyrosequencing）

优势：相对于SNaPshot，通量进一步增大，可以分析96个样本的SNP，不需要制胶，不需要毛细管电泳，也不需要荧光染料和同位素。分析简单，结果直观。

劣势：价格昂贵。

4. Taqman探针技术

优势：金标准，准确度高，适合样本多、位点数量少的检测。

劣势：价格昂贵（探针合成费用高），仅检测已知SNP位点，通量小，一般为少数几个位点适用，对于样本的质量要求较高，除了样本无降解外，还需要浓度尽可能的一致，这样结果才会比较集中。

5. Microarray芯片法

优势：高通量，适用于全基因组SNP扫描，适用于少样本、大量SNP位点筛查；

劣势: 准确度偏低，需要用测序或Taqman探针法进行验证；只能识别已知SNP位点；不适宜多样本、中低SNP位点的检测；价格昂贵。

6. Sequenom MassARRAY

优势：成本较低，不需要合成特殊的荧光引物，只需要一对PCR引物以及延伸引物即可；检测方便，灵敏度高，数据准确性有保证。

劣势：对于SNP位点两侧序列要求较高，存在特殊序列，如SNP位点，插入缺失等会影响准确性。另外，对于样本质量稍微有些高，后期补数据较为麻烦，如果样本质量不是很好的，建议谨慎选用；单次反应可检测的SNP位点在20-40之间，超过这个数量的位点需要分布在不同的Panel中，增加了成本。

Fluidigm与SNP分型的金标准Taqman的数据具有高度的一致性，在高质量的DNA条件下，能达到99.9%的检出率和99.75%的准确度。

综上所述：中低通量SNP验证研究（几百~几千样本中，检测几十个SNP位点）选择Fluidigm平台进行检测，在单个SNP位点成本、检测周期，相对于其它检测平台都具有明显的优势。同时，检测灵敏度和准确率与金标准的Taqman具有高度一致性。

服务优势：

• 高通量，成本低：上千样本，几十至数百SNP位点，都可以检测，样本量和位点数越高，每个样本的每个位点检测成本越低。

• 灵敏度高：位点特异性探针，荧光标记的延伸引物，与Taqman金标准吻合度高。

• 时间短：从样本处理到拿到数据3-4个小时。

• 灵活性：任意物种，只要知道目的序列，的探针可以定制。

五、 Fluidigm SNP 分型应用范围

• 人类基因组研究和药物基因组学研究

• 分子标记辅助育种和家畜遗传标记追踪

• 商业化转基因作物的检测和定量

• 分子标记筛选优良性状的农作物

• 渔业管理和野生动物种类的遗传标记的追踪

• 生物技术服务实验室的遗传鉴定和质控

基于Fluidigm BioMark系统的基因分型检测介绍

Fluidigm高通量基因分析系统（BioMark™），是集成了流体通路（Integrated Fluidic Circuit，IFC）技术、实时定量PCR技术及强大的基因分析软件的技术平台。IFC 将微流控通道、阀门和反应仓集成在一张芯片上，通过一个控制系统自动完成多达9216个PCR反应。集成流体通路技术极大地简化了生物样品和试剂的分液操作，提高分析通量和灵敏度，其纳升级的反应体系为高通量的基因分析应用节省大量成本、试剂用量和样品需求量。

技术原理

Fluidigm的SNP检测技术与Taqman类似，是基于终端荧光读取判断，每孔采用双色荧光检测一个样本的一个位点可能的两种基因型，不同的SNP模板对应不同的荧光产物。技术上的不同点在于，Taqman针对每一个特定SNP位点单独合成带两种标记的探针，而Fluidigm的SNPType探针是由2条特异上游引物和1条通用反向引物组成，特异引物不带荧光标记，反应体系中加入带有FAM和HEX标记的通用探针，可以实现同时检测多个SNP，从而大大降低了探针的成本。

1. 准确度：Juno平台的实验原理与Taqman一样，是基于实时定量PCR的技术手段，基因分型的准确率>99%。

2. 特异性：Taqman探针，一般选用8-12bp长度在SNP位点两端设计，可能导致多个同源序列扩增，引起背景增高，杂交信号降低，KASP的引物为24-26bp，特异性更高，SNP call rate 会更高，达到99.9%。

3. 成本低：纳升级的反应体系十分节省试剂；对于每一个特定位点单独合成的探针，KASP的非荧光标记的引物，保质期长，而Taqman的针对特定位点的探针是荧光标记的，保质期短，成本高，用不掉会浪费。而KASP荧光标记的Master mix为通用型消耗品，可根据实验用量酌情采购，不会浪费。

4. 通量高：一次芯片最多可进行9216个反应。

5. 灵活性：选择已有探针或定制新探针，自由组合panel。任何种属的相应序列，经过预扩增验证后设计探针，有效提高低质量、低浓度或珍贵样本的分析结果。

芯片规格类型

Biomark™ HD系统配套的检测芯片有如下几种格式，满足不同SNP位点和样本数的研究需求，分别为：

1. 12*12（12样本*12位点）；

2. 48*48（48样本*48位点）；

3. 96*96（96样本*96位点）；

4. 192*24（192样本*24位点）。

服务流程

方案设计——合同签订与送样——样本抽提质检——探针引物预实验——将样本和SNPType引物试剂加到芯片上——将芯片置于Juno系统中，自动进行分液、混合和PCR反应——在Biomark HD上采集数据——软件分析数据

样本要求

1. 样品浓度50ng/μl-100ng/μl，体积5-10μl；

2. OD260/280=1.8-2.0，OD260/230=2.0-2.4；

3. 电泳主带清晰，无明显降解；

4. 无蛋白和RNA污染；

5. 特殊样本，如FFPE等，可以降低条件，但是有风险。

仪器平台

• Fluidigm® BioMark™ HD + Juno高通量基因分析系统

参考文献

[1] Yang et al. Genetic variant of IL-10RA and susceptibility to rheumatoid arthritis in a Chinese population. Clin Rheumatol. 2017 Apr, 36(4):825-830.
[2] Ni et al. Genetic Polymorphism (rs329498) in the Pellino-1 Gene as Possible Predisposal Factor for Systemic Lupus Erythematosus in a Chinese Population. Immunol Invest. 2016 Mar 28:1-10.
[3] Chen et al. Role played by the SP4 gene in schizophrenia and major depressive disorder in the Han Chinese population. Br J Psychiatry. 2016 May, 208(5):441-5.
[4] Zhang et al. Associations of genetic variations in EYA4, GRHL2 and DFNA5 with noise-induced hearing loss in Chinese population: a case- control study. Environ Health. 2015 Sep 24; 14: 77.