宏基因组测序在疾病研究中的应用解决方案

1. 研究背景

微生物广泛地存在于人类所处的生活环境中；同样地，微生物对人类健康的影响也具有多样化的特点。已有研究发现，牙周炎/口腔癌（口腔），IBD/CRC/IBS（肠道），银屑病（皮肤）；糖尿病，冠心病，肾结石，肝硬化，胰腺癌，肝癌，慢性阻塞性肺病，肺囊性纤维化，尿道炎/阴道炎/宫颈癌（生殖泌尿）；自闭症，精神分裂症（神经），白血病（循环）等疾病均与微生物有关。因此，研究疾病患者体内微生物群落结构及基因功能对疾病的治疗和预防具有重要意义。

2. 研究方法

16S rDNA扩增子测序：通过选择特定通用引物，对16S rDNA特定区域进行PCR扩增，进而通过新一代测序技术对该区域进行测序，来分析样本中微生物的群落结构多样性。

宏基因组测序：利用二代测序技术对样品中微生物的群体基因组进行测序，从而解析微生物群体的物种多样性、进化关系、基因组成、功能多样性及微生物与环境/宿主之间的关系，为发掘和研究特定功能的新基因提供了便利。

3. 研究思路

4. 样本要求

5. 分析流程

6. 分析结果展示

16S rDNA扩增子测序部分分析结果示例

a) 样本间OTU分布和物种组成

b) 微生物群落结构在不同样本组间是否存在差异（PCA, NMDS和PCoA）

PCA（主成分分析）：运用方差分析，将多组数据的差异反映在二维坐标图上，坐标轴取能够最大反映方差值两个特征值。如果两个样品距离越近，则表示这两个样品的组成越相似。

NMDS（非度量多维定标法）：非度量多维定标法常用于比对样本组之间的差异，可以基于进化关系或数量距离矩阵。图中点之间的距离越近，反映样本间组成越相似。

PCoA（主坐标分析）：是一种研究数据相似性或差异性的可视化方法，通过PCoA 可以观察个体或群体间的差异。图中点之间的距离越近，反映样本间组成越相似。

c) 哪些物种在不同组间存在着差异（LEfSe分析）

LEfSe（Linear discriminant analysis Effect Size）线性判别分析是用于发现不同生物条件或环境下的两组或多组样本中最能解释组间差异的基因或功能特征。不同的区域表示不同分组，树枝中红色节点表示在红色组别中起到重要作用的微生物，绿色节点表示在绿色组别中起到重要作用的微生物类群，黄色节点表示的是在两组中均没有起到重要作用的微生物类群。

d) 哪些因素影响了物种的组成（RDA/CCA分析）

RDA/CCA分析主要用来反映菌群与环境因子之间的关系。RDA 是基于线性模型，CCA是基于单峰模型。分析可以检测环境因子、样品、菌群三者之间的关系或者两两之间的关系。环境因子之间的夹角为锐角时表示两个环境因子之间呈正相关关系，钝角时呈负相关关系。环境因子的射线越长，说明该影响因子的影响程度越大；备注：需要客户提供环境因子数据

a) 物种注释和丰度信息

b) COG注释和KEGG注释

c) 组间LEfSe差异判别分析

7. 案例解析

案例1、口腔微生物与肺部微生物及炎症关系的研究

近年来肺部微生物与宿主的关系已开展了很多研究，由健康人的研究结果可总结为两种类型，分别是pneumotype（SPT）和pneumotype（BPT）。SPT型的Prevotella 和 Veillonell等细菌较多；而BPT型则细菌含量少，多数为试剂和仪器造成的背景菌为主。SPT可以真实反映上呼吸道微生物结构，而BPT主要反映环境引起的误差。目前已有研究发现，健康人的肺泡灌洗液样本中富集了口腔微生物，同时淋巴细胞和中性粒细胞数目增多。但是慢性呼吸道炎症人群中肺部微生物在炎症和免疫中的机制还不清楚。因此，我们运用多组学的方法对此炎症现象进行研究。本研究收集49个个体的肺泡灌洗液（BAL）和上呼吸道样本，分为NYU 、OSU和LHMP三组，利用 Illumina Miseq +454测序平台进行16S rDNA测序，后续进行α-多样性、PCA、群落结构、KEGG注释、LEfSe组间差异比较等生物信息学分析。

原文出处： Segal L N, Clemente J C, Tsay J C J, et al. Enrichment of the lung microbiome with oral taxa is associated with lung inflammation of a Th17 phenotype. Nature Microbiology, 2016, 1: 16031.

案例2、婴儿肠道微生物的宏基因组研究

众所周知，新生婴儿肠道处于几乎无菌的状态，随着年龄的增长，其肠道微生物与刚出生时有显著不同。那么人类肠道中的微生物是如何建立起来的，又有哪些因素影响了微生物呢？本文作者利用宏基因组方法研究了瑞士98对母婴的肠道微生物，同时比较了顺产和剖腹产，以及母乳喂养和奶粉喂养对婴儿肠道菌群的影响。研究发现：不同月龄婴儿的肠道微生物组成和功能有显著差异，其中一岁婴儿的肠道菌群与母亲的肠道菌群结构更加相似；并且随着婴儿的不断成长，微生物的种类逐渐减少，而物种的丰富度增加。顺产的婴儿肠道微生物与母亲的更加相似。停止母乳喂养可以加速婴儿肠道微生物的成熟。标志微生物的改变显示婴儿肠道微生物的非随机变化。营养的改变和异型生物质的代谢的变化标志肠道微生物的成熟。本研究选取98个婴儿（新生儿，4个月，12个月）及母亲的粪便样品（15个剖腹产，83个顺产），采用 Illumina Hiseq2000测序平台的PE100测序方法，进行后续的α-多样性、β-多样性、KEGG、CAZy注释等生物信息学分析，从而分析不同月龄、不同喂养方法、不同分娩方式出生的婴儿肠道微生物的差异。

原文出处：Bäckhed F, Roswall J, Peng Y, et al. Dynamics and stabilization of the human gut microbiome during the first year of life. Cell host & microbe. 2015