中低通量核酸检测

（一）中低通量核酸检测

      核酸检测主要包括：定量PCR的Taqman法、sybgreen法等检测；branch DNA技术的mRNA,miRNA, LncRNA或基因拷贝数检测； PCR产物测序或克隆测序； 焦磷酸测序； MassArray 检测； PCR Array 检测等内容。

技术及应用
 低通量多基因验证技术
——采用Panomics的branch DNA-QGP技术对mRNA，miRNA等进行检测
——拥有Qiagen的PCR-Aaary低密度芯片技术，进行基因Pathway水平检测
——拥有ABI的TLDA低密度芯片技术，进行低通量核酸水平检测
 常规测序技术
——进行甲基化、SNP、突变验证检测，PCR产物测序或克隆测序
 焦磷酸测序技术
——适合进行DNA甲基化检测，也可进行突变检测等遗传学分析
 荧光定量PCR技术
——Taqman探针进行SNP位点检测，Taqman探针及Sybgreen探针进行多个或单个基因或MicroRNA表达水平等验证、拷贝数等变化等检测
 荧光核酸检测技术
——ViewRNA及FISH技术
 MassArray 检测
——可用于SNP分型、甲基化分析、CNV分析等。本平台承接用该技术检测SNP业务

基于bDNA技术的检测服务
     Affymetrix公司旗下的Panomics开发出的Branch-DNA（bDNA）技术是一种三明治结构的核酸杂交方法，该方法采用 bDNA 分子放大捕获的目标 RNA 信号。bDNA 测定的优势是直接从样本中获得RNA进行分析，无需对 RNA 进行提纯或酶处理，从而避免了这些过程中可能引起的分析效率下降以及RNA降解。
该技术目前已应用到基础研究和临床前期研究等各领域中。SBC还将 bDNA技术与Luminex / BioPlex平台相结合，为您提供蛋白分析、核酸分析和RNA原位分析等服务。

服务内容：核酸分析
核酸分析原理
     Affy-Panomics技术所有技术基于Branched DNA (bDNA) 技术原理：是一种三明治结构的核酸杂交方法，该方法采用 bDNA 分子放大捕获的目标 RNA 信号。

技术特点
 同时定量测量多个 RNA或DNA 目标，准确性与精确度无与伦比
 RNA 与DNA定量直接来源于培养细胞、全血或组织（新鲜、冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋 (FFPE)）
 无需抽提纯化RNA或DNA
 RNA无需反转录
 无目标放大
 简单的测定流程

技术组成
 定量检测技术：
单基因：Quantigene
——实现单个基因的准确定量检测，具有很高的灵敏度，可检测低至200-500个拷贝到核酸分子；
多基因定量检测技术：Quantigene Plex
——同一反应中可同时检测3-36个基因的表达水平，同时实现这些核酸分子的准确定量检测，；
——特别适用于血液样本和保存，以及多年后mRNA高度降解的FFPE样本,；
——同时适用于基因拷贝数的检测, 可以分辨0.5-4个拷贝，以及MicroRNA、LncRNA等等检测；操作简便，优于Q-PCR技术。

 荧光基因原位杂交检测技术：
ViewRNA技术： 
     基于b-DNA技术原理，进行原位杂交实验，结果为图像，可以定性和半定量分析目标基因的表达及分布情况。
——单细胞水平检测低至一个拷贝的mRNA, 在定量与结构生物学水平原位检测多基因的mRNA, 在抗体无法获得情况下, 对免疫细胞化学研究是一种极好的补充。

1. 单基因表达精确定量服务
产品推荐：QuantiGene® 2.0系列产品

服务特点：
 无需抽提纯化RNA、无需反转录、无需PCR扩增；
 可分析各种样本（组织、细胞、血液、福尔马林浸泡、石蜡包埋等），只需用特定裂解液裂解即可，对样品量下限无要求（只需 mRNA拷贝数在检测范围内）；
 该技术也可用于转基因动植物的DNA拷贝数检测、DNA拷贝数变化等分析用途。

实验流程：

2. 多基因表达精确定量服务
     产品推荐：QuantiGene® Plex 2.0 系列产品

服务特点：
 同一反应中可同时对3-36个基因；
 在定量与结果细胞生物学水平原位检测多基因的核酸分子，特别适用于血液样本和保存
 多年后mRNA高度降解的FFPE样本；
 在抗体无法得到的情况下，对免疫细胞化学研究是一种极好的补充。

实验流程：

Quantigene定量检测技术的应用：
 表达谱芯片数据的验证
 DNA拷贝数的检测
 临床FFPE样本和血液样本的多基因表达检测
 —信号传导通路检测
 —药物筛选及siRNA筛选样本特定目标基因的检测
 标志物基因与药物靶点验证，等

应用举例
一、多基因的表达水平变化
     在前列腺肿瘤石蜡样本中进行多基因检测：
Knudsen et al J Mol Diagnostics 2008
该文提到在石蜡样本中成功进行14个前列腺癌相关的标志基因检测。

     Macro dissected FFPE samples from matched tumor and normal tissues homogenized in Tissue Homogenization Solution (THS). 14 prostate cancer gene panel measured in tumor and adjacent normal tissues. Gene expression normalized to housekeeping gene RPL19. The ratio between tumor and normal tissues is calculated and shown in a 5-tiered categorical scale. “In macrodissected tissues from 9 – 13 year old blocks with poor RNA quality, the QuantiGene® Reagent System correctly identified the over-expression of known cancer
genes (arrows).”
“In conclusion, the QuantiGene® Reagent System appears to be well suited for clinical analysis of FFPE tissues with diagnostic or prognostic gene expression biomarker panels.”

二、基因拷贝数的验证
     SULT1A1 DNA Copy Number Ethnic Groups, Human Molecular Genetics 2007 
     该文提到在不同美国人种群的大量样本中验证特定基因SULT1A1的拷贝数变化。

     Yali Xue et al The American Journal of Human Genetics 83, 337–346, September 12, 2008
     该文提到在全球不同人种群的大量样本中验证特定基因UGT的拷贝数变化。

服务内容：核酸原位分析
1 单细胞多基因单拷贝核酸分子原位检测服务
产品推荐：QuantiGene® ViewRNA系列产品

服务特点：

• 单细胞水平检测单拷贝核酸分子；

• 在定量与结构细胞生物学水平原位可检测2个以上的核酸分子；

• 在抗体无法得到的情况下，对免疫细胞化学研究是一种极好的补充。

单基因荧光原位杂交ViewRNA检测技术应用：

• mRNA原位表达水平及分布检测

• microRNA原位表达水平及分布检测

• lncRNA原位表达水平及分布检测

• 基因拷贝数原位表达水平及分布检测
  

应用举例
一、应用ViewRNA技术检测CK19在乳腺癌样本中的表达和分布

二、ViewRNA技术与放射性原位杂较技术比较
     Arany E., et al J Clinical Endocrinology & Metabolism
     该文比较了ViewRNA技术与放射性原位杂较技术，ViewRNA技术更方便，快捷，安全。

基于PCR-array技术的检测服务
RT2 Profiler PCR Arrays芯片
     基于real time RT PCR技术，以阵列方式高通量集成检测，研究通路或疾病相关基因的表达。阵列选择覆盖癌症、凋亡、信号转导、细胞因子、炎症反应、细胞毒理、药物代谢、干细胞及发育生物学、神经科学等方面。操作简单，无需优化。

技术优势
结果高度敏感性，精确性，可复制性：
     1）科学和完整的参照系统：
对每个样本都设立了多个housekeeping gene （HKG）、genomic DNA contamination参照 、逆转录效率参照（RTC）、阳性PCR 反应条件参照（positive PCR control），确保了每一步实验的精确性符合发表q-PCR数据的国际标准ＭＩＱＥ。
     2）严格的质控过程：
PCR Array三个步骤涉及的试剂，引物实验条件均经实验验证，确保均一和高度扩增 效率 (Aplification Efficiency 100%)，特异性(单峰分离曲线)，敏感性（1ng/96-well plate）和宽广的线性范围(wide dynamic range 10⁸)

是操作简单，节约时间的即用型反应系统：
在几个小时内一次性检测84 or 370个基因的表达水平， 所有实验条件均已设定，经过验证，无需优化条件。利用在线分析工具可以在15分钟内处理数千个Ct值，用户只需经过简单培训

基因选择具有科学性和时效性，目标在于解决生物学问题：
PCR Arrays上基因的选择过程。这些被选中的基因并不仅仅是简单的包括某个信号通路中的所有基因，所选基因必须对于相应的信号转导途径相当重要，并且是在mRNA水平上调控的。研发人员及生物信息学科学家通过阅读已发表文献， 从疾病发病，进展，治疗， 耐药性，等多方面入手。研发部门做了大量实验来证明所选基因的相关性。另外，我们与学术界的权威密切合作，所选的所有基因都通过了他们的认可。

产品应用广泛：
有大于1000多篇文献引用了PCR Array数据，其中包括在Science，PNAS等杂志上发表的文献。 全球有1000多个实验室（包括300多个大学）在使用该产品，中国各地机构有北京/上海/武汉中科院， 中山肿瘤医院等。