蛋白互作鉴定 CO-IP、GST-pulldown、酵母双杂交系统

蛋白质组定性分析

Qualitative analysis of proteomics

蛋白质纯定性分析实验主要是利用液质联用仪对酶解后的肽段进行检测，然后与对应物种的蛋白序列库进行比对，得到该样品中存在哪些蛋白，以及这些蛋白的肽段序列、等电点等信息。 

此类服务主要包括以下内容： 

•  蛋白样品/胶条/IP蛋白产物等形式的样品处理（蛋白酶解、除盐等）

•  质谱检测

•  数据库检索

•  检索结果及数据报告

产品介绍

胶条/溶液鉴定

co-ip/Pull down/SDS-Page条带等蛋白溶液---LCMSMS鉴定 

胶条鉴定是目前使用最广泛的蛋白质组学研究手段，聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis）分离蛋白质混合物，收集目的胶条，经胶内酶解后用于质谱分析以获得蛋白质信息。

实验原理

鹿明生物采用LCMSMS技术进行蛋白胶条鉴定，并对胶内酶解法进行系列优化，通过与数据库的检索，推断得到与之可能性最高的匹配蛋白。

技术的特点

实验流程

样本要求

送样要求 

蛋白干粉，胶条封存于ep管内，4℃（冰袋）运输；溶液样本干冰运送

仪器设备

Thermo Q-Exactive高分辨质谱 

Sciex Triple TOF 6600质谱仪

服务流程

小鹿智囊 

需要研究人员根据自己研究的相关生物学背景，再结合生物信息学分析的结果，以及查看相关的文献资料来确认哪些蛋白可以用于后续深入的研究。后期的蛋白验证实验，一般情况下是根据客户的需要，结合课题本身，在所筛选到的差异的蛋白中，找到自己关注的蛋白。并且在挑选的时候尽量挑蛋白可信度高的、差异变化较明显的蛋白。PS：目前验证实验的成功率比较低，一般情况下能有50%的概率已经是非常好的结果。

因为一个蛋白家族中常常含有多个同源性很高的蛋白质，这些蛋白质被酶切之后，很可能会产生很多相同的肽段，软件在进行定性分析时，就会将这些肽段均归于得分最高的那种蛋白质，其他同源蛋白不计分，并且这些同源蛋白都采用同一编号。

质谱鉴定不成功主要可以分为两类，一类是质谱效果不好，一类是没有可参考的蛋白数据库，质谱效果不好的原因又可以细分为蛋白点太淡以至于蛋白含量过低（常见银染的点）、蛋白酶解及质谱操作失误等，要避免这些因素需要尽量取颜色深一些的蛋白点，并且取的蛋白点面积需要适当大一些，对于某些很小但很清晰的蛋白点，取点的时候可适当选择孔径大一些的枪头，把边上空白处适当取到一些也不要紧，避免取点混入其他的蛋白点。其次，由于没有合适的数据库导致的鉴定效果较差，可以通过更换范围更大的数据库、近缘物种数据库、采用相关研究物种的蛋白、EST数据库等构建本地数据库的方式进行解决。

1.  3、蛋白质谱鉴定不成功一般有哪些因素? 

1.  2、做蛋白鉴定时，检索时为什么同一个编号对应了很多蛋白质？

2.  1、如何来判定哪些蛋白是和自己研究相关的蛋白，挑选什么样的蛋白来进行后期的验证实验？

   
   

实例分析

对覆膜出水的蛋白质组学前瞻性分析以发现覆膜硬化的分子标志

基本信息
材料：覆膜出水样本                                                   主要技术：iTRAQ，2DE
期刊： Kidney Int                                                    影响因子：8.395

文章摘要
覆膜硬化症（EPS）是腹膜透析（PD）的并发症之一，致命性高。但是由于准确诊断工具的不足，造成EPS的诊断延误。出于此，课题组收集前瞻性样本，希望通过蛋白质组学技术，检测覆膜出水的蛋白表达情况，找到有效的biomarker用于预测和诊断EPS。同时运用组合肽配体库降低样本中高丰度蛋白的干扰，来检测更多的低丰度蛋白。对膜功能稳定的病人，在透析过程中随时间增长，纤维蛋白原G链蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的含量增加；覆膜硬化患者的纤维原α1(I)、γ-肌动蛋白、补体因子B、补体因子I在明确诊断的5年前都有上升的迹象；血清类粘蛋白-1和a2-HS-糖蛋白B链在明确诊断的1年前表达上升；同时载脂蛋白A-IV，α1-抗胰蛋白酶表达却下降；与刚开始腹膜透析的病人相比，内凝集素-1、皮肤粘蛋白、凝溶胶蛋白和视黄醇结合蛋白-4表达上调。腹膜出水的前瞻性分析具有揭示炎症和促纤维化损伤的功能，同时也可以进一步用于EPS的诊断/预后标志物。

方法流程

综合分析

小鹿推荐
文章对EPS做前瞻性分析寻找Biomarker，为了提高准确性。采用两种组学技术：先用2DE/MS技术建立以时间轴为梯度的蛋白分析，因为2DE/MS的分辨率较低，又运用一组样本进行iTRAQ实验，提高了差异蛋白的检出效率，又能够结合前面的分析，增强说服性；为避免因高丰度蛋白造成的干扰，采用proteome mining去除高丰度蛋白，同时对去高丰度前后做比较。对于样本选择采用每个时间点5个样本混样，避免个体差异的干扰。这些设计提高了biomarker的准确性，为后续的科学研究提供了可靠的新数据。

文献来源
Vasileios Z. et al., A prospective, proteomics study identified potential biomarkers of encapsulating peritoneal sclerosis in peritoneal effluent. 2017, Kidney Int.