药物综合研究方案

基于TCGA、GEO大数据或吉凯数据库或客户样本，筛选具有抗肿瘤效果的中药单体下游发挥作用且未在所研究肿瘤中被报道过功能的新功能基因，对所筛选到的基因进行细胞、体内水平的多种实验验证，并探讨所筛选基因潜在作用机制，为抗肿瘤中药药物的作用靶点以及生物标志物的确定提供前期的数据基础。

技术原理

通过全基因表达谱芯片分析具有抗肿瘤作用的中药单体作用于肿瘤细胞株后的全基因表达变化，在这些差异基因中，中药单体刺激下表达下调的基因，很可能是促进肿瘤细胞增殖的驱动基因，这些基因可以被该中药单体抑制，从而抑制细胞增殖。结合吉凯基因疾病关键基因专利数据库和高内涵功能基因筛选平台（HCS），从这些中药单体处理后下调的基因中筛选出在所研究肿瘤中没有报道过的，并在肿瘤细胞增殖过程中发挥重要调控作用的下游靶基因。完成该靶基因在细胞和动物体内水平的功能学实验，通过补充研究方案,阐明这些关键基因发挥功能的分子机制，从而探讨该中药单体的作用机制。

结果展示

1. 中药单体抗肿瘤功能预实验：

根据客户提供的中药单体，在肿瘤细胞株上进行IC50测定，确定具体使用浓度、条件和持续时间，通过MTT克隆形成细胞凋亡细胞周期划痕愈合等实验验证中药单体的有效性。

2. 基因芯片筛选中药单体处理后差异表达基因：根据预实验确立的中药单体应用条件处理细胞，抽提总RNA，与对照组进行全基因表达谱芯片检测，通过信息学分析，筛选差异表达显著的基因，挑选约25-40个下调差异基因进行qPCR验证，确定20个候选差异基因。

示例图

3. 初步筛选功能靶基因：将20个候选基因shRNA慢病毒分别感染靶细胞，每个基因3个复孔，使靶细胞内源表达的候选基因表达下调，通过Cellomics高内涵功能筛选（HCS）平台,对感染后的细胞进行4～5天细胞计数，观察候选基因表达下调后的细胞与对照细胞相比细胞增殖的变化，初步筛选到约1-2个对细胞增殖有影响的靶基因。

示例图：

4. 对筛选到其中一个功能靶基因进行完整的细胞功能学研究：通过qPCR和WB验证目的基因B在细胞中的敲减效率，并在肿瘤细胞株上进行MTT/细胞周期（PI/流式法）/凋亡（Annexin V/流式法）/BrdU/克隆形成等增殖方向的功能学实验。分组：NC vs KD，每组三个复孔。承诺在一株肿瘤细胞中至少4个增殖方向功能学（含HCS增殖检测）阳性结果，两株肿瘤靶细胞中至少3个增殖方向的功能学阳性实验结果或者在3株肿瘤细胞中至少2个增殖方向功能学阳性结果。

示例图：

5. 对功能靶基因进行的动物体内功能学研究：制备靶基因敲低实验组或对照组成瘤细胞，注射裸鼠，饲养裸鼠至瘤体长成，记录动物体重，瘤体大小曲线，处死后收集瘤体称重，处理数据结果。

示例图：

6. 靶基因作用机制研究：通过细胞免疫荧光、Patharray下游通路分析、下游经典通路WB验证、Co-IP质谱分析互作蛋白、干性检测、衰老检测、DNA甲基化检测、乙酰化检测、泛素化检测、自噬机制检测等补充研究方案,验证靶基因可能的致病分子机制。

以下以Patharray下游通路分析为例：

通过全基因表达谱芯片检测靶基因干扰组细胞和对照组细胞下游差异基因，对差异基因进行IPA生信分析，并进行qPCR和WB验证，分析靶基因下游通路。

示例图：

7、靶基因与药物功能回复实验分析：构建靶基因过表达慢病毒，WB验证目的基因表达效率，在肿瘤细胞株中感染靶基因过表达慢病毒，并和中药单体共同处理，通过CCK8等实验检测细胞的增殖情况，观察药效是否减弱

研究技术路线

参考文献

1.Xu et al. Chrysin inhibited tumor glycolysis and induced apoptosis in hepatocellular carcinoma by targeting hexokinase-2. J Exp Clin Cancer Res. 2017;36(1):44. doi: 10.1186.

2.Liang et al. SESN2/sestrin 2 induction-mediated autophagy and inhibitory effect of isorhapontigenin (ISO) on human bladder cancers. Autophagy. 2016;12(8):1229-39. doi: 10.1080.