肿瘤新药靶IncRNA双靶点研究方案

基于TCGA大数据，分析验证未在所研究肿瘤中被报道过功能或临床相关性的新lncRNA功能基因，探讨其致病的分子机制，为后续抗肿瘤药物的靶点以及生物标记物的确定提供前期数据基础。

技术原理

长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA。越来越多的研究表明lncRNA在肿瘤的发生发展中起到了重要作用。通过TCGA大数据，分析出在癌组织中高表达或者表达与疾病分期分级相关的lncRNA，通过吉凯基因疾病关键基因专利数据库，分析出在所研究肿瘤中没有报道过的候选lncRNA，利用慢病毒介导的RNAi技术，对若干个候选lncRNA分别进行RNAi，通过Cellomics高内涵功能筛选（HCS）平台，对感染后的细胞进行4～5天细胞计数，寻找到对细胞增殖有影响的目的lncRNA，通过FISH实验确定目的lncRNA的细胞内定位。并获得针对该lncRNA两个干扰靶点在一株细胞上的至少3个增殖方向功能学实验（MTT/细胞周期（PI/流式法）/凋亡（Annexin V/流式法）/BrdU/克隆形成等）以及2个转移方向功能学实验（划痕愈合/Transwell迁移/Transwell侵袭等）阳性结果。在一株细胞株上对目的lncRNA进行干扰后，进行转移相关经典通路组合panel*的WB验证。根据WB panel结果选择一个阳性机制基因，构建该机制基因干扰或过表达病毒，在细胞株上干扰目的lncRNA的同时干扰或过表达下游机制基因，通过HCS连续5天扫版观察细胞增殖能力的变化，验证下游机制基因对目的lncRNA的功能回复作用，并获得一个增殖相关和一个转移相关功能学实验的阳性回复实验结果。

*转移相关经典通路组合panel：AKT1、p-AKT（Ser473 or Thr308）、mTOR、p-mTOR（Ser2448）、ERK1/2、p-ERK1/2（Thr202+Tyr204）、P38、p-P38（T180+Y182）、MYC、β-Catenin、p-β-Catenin（S33+S37）、NFkB-p65、p-NFkB-p65（Ser536）、CDH1（E-Cadherin）、CDH2（N-Cadherin）、MMP2、MMP9、FN1、VIM、Snail、Slug、TWIST等22个基因。

结果展示

1. 初步筛选目的功能lncRNA：通过TCGA大数据，分析出在癌组织中高表达或者表达与疾病分期分级相关的lncRNA，将候选lncRNA shRNA慢病毒感染靶细胞，使靶细胞内源表达的候选lncRNA表达下调，通过Cellomics高内涵功能筛选（HCS）平台，对感染后的细胞进行4～5天细胞计数，观察候选lncRNA表达下调后的细胞与对照细胞相比细胞增殖（或划痕愈合）的变化，从而推断对细胞增殖（转移）有影响的lncRNA。

注：最后提供一个阳性lncRNA@一株细胞的数据，含Negative Control（NC）和目的lncRNA RNAi两组结果。阴性基因数据不提供。

示例图：

2. 目的lncRNA细胞功能验证：分别用针对目的基因的两个shRNA慢病毒在靶细胞中沉默目的lncRNA，qPCR验证两个干扰靶点的敲减效率，用目的lncRNA探针FISH验证目的基因胞内定位，并在一株细胞上进行MTT/细胞周期（PI/流式法）/凋亡（Annexin V/流式法）/BrdU/克隆形成等增殖方向的功能学实验以及转移方向功能学实验（划痕愈合/Transwell迁移/Transwell侵袭等）。分组：NC vs KD1 vs KD2，每组三个复孔。承诺两个干扰靶点在一株肿瘤靶细胞中该lncRNA敲减后的至少3个增殖方向（含HCS增殖检测）的功能学阳性实验结果或者2个转移方向（含HCS转移检测）的功能学阳性结果。

示例图—增殖方向实验：

示例图—转移方向实验：

3. 目的lncRNA下游机制分子检测：在一株细胞中对目的lncRNA进行干扰，抽提细胞蛋白，与对照组相比进行转移相关的经典基因panel的WB检测，分析下游分子机制。

示例图：

4、下游机制分子与目的lncRNA的功能回复验证：根据实验3中WB panel结果选择一个阳性机制基因，构建该机制基因干扰或过表达病毒（携带红色荧光），在细胞株上干扰目的lncRNA（感染携带绿色荧光的干扰慢病毒）的同时干扰或过表达下游机制基因（感染携带红色荧光的干扰或过表达慢病毒），通过HCS连续5天扫版观察黄色荧光细胞增殖能力的变化，验证下游机制基因对目的lncRNA的功能回复作用，并获得一个增殖相关和一个转移相关功能学实验的阳性回复实验结果，实验分组：NC（目的lncRNA）+NC（下游机制基因）；KD（目的lncRNA）+NC（下游机制基因）；KD（目的lncRNA）+KD/OE（下游机制基因）。

研究技术路线

参考文献

1.Song et al. Long noncoding RNA GAS5 inhibits angiogenesis and metastasis of colorectal cancer through the Wnt/β‐catenin signaling pathway. J Cell Biochem. 2019 ; doi: 10.1002.

2.Zhu et al. Knockdown of LncRNA GHET1 suppresses prostate cancer cell proliferation by inhibiting HIF-1α/Notch-1 signaling pathway via KLF2. Biofactors. 2019. doi: 10.1002.

3.Yin et al. Increased long noncoding RNA LASP1‐AS is critical for hepatocellular carcinoma tumorigenesis via upregulating LASP1. J Cell Physiol. 2019;doi: 10.1002.