核体系酵母文库-欧易生物

核体系酵母文库

酵母双杂交（Yeast two hybrid）技术是利用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用，已被广泛应用于蛋白质组学、细胞信号转导和功能基因组学等领域，已成为分子生物学研究领域的重要实验手段。经过不断的完善和发展，不但可以检测已知蛋白质之间的相互作用，更重要的是还可发现与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

欧易生物结合多年的文库构建经验，推出两套酵母双杂交文库构建体系：
一是SMART体系，在现有酵母双杂交文库构建流程（BD MatchmakerTM library）基础之上加入独特步骤，使文库中高丰度表达基因明显降低，从而使文库丰度均一提高筛选阳性率；
二是Gateway体系，采用Gateway位点特异性重组技术（Cloneminer cDNA library construction kit）构建文库。

应用领域

检测细胞核内发生互作的蛋白质，基于转录因子的转录激活域AD与DNA结合域BD分别构建融合基因，通过激活报告基因表达，探测蛋白互作。
部分服务单位：中科院上海植物生理生态研究所、上海交通大学、浙江大学、浙江省农科院、山东省农科院
部分物种：人、小鼠、大鼠、对虾、水稻、拟南芥、牡丹、稻飞虱、苹果、油菜、小麦、烟草、银杏、土豆、西瓜、棉花

- A - SMART体系
欧易特色
均一化可有效降低高丰度基因的含量，从而提高筛选阳性率
同源重组一步完成
酵母文库可用于双杂、单杂、三杂
若需转化酵母，可提供100管酵母甘油菌工作液及1-3管母液

- B - Gateway体系
欧易特色
mRNA反转录成cDNA构建文库，不经过PCR可避免冗余现象，保证文库质量
采用Gateway技术进行建库，欧易提供的初级文库可当做普通cDNA文库使用
三框型接头可保证蛋白正确表达
欧易提供的次级文库质粒既可用于共转筛库又可用于mating筛库
如次级文库用完，可用初级文库与AD载体重组以获得次级文库
酵母文库可用于双杂、单杂、三杂
如客户转化酵母，欧易可提供100管酵母甘油菌工作液及1-3管母液

提供内容
实验报告：详细实验流程、各阶段电泳图、工作液细胞密度、文库库容量、插入片段长度鉴定图等

Gateway体系可提供初级、次级文库质粒及菌液

两种体系比较

案例展示
案例一  SMART体系——GS9作为转录激活因子控制水稻粒型和外观品质

研究背景
水稻的粒形是水稻产量和品质的关键决定因素之一。一般而言，大粒径高产但品质差。因此水稻育种的一个重要目标是高产加理想的粒形。目前的研究已经克隆了几个控制水稻粒形的基因的主效QTL，其中大多数基因控制颗粒大小和产量，但对于外观品质改善有限，并且对这些基因的调控机制和调控网络研究并不清晰。因此，筛选决定粒形的其他基因/ QTL，对于进一步揭示谷粒性状分子决定机制、培育高产质优品种具有重要意义。

研究内容
研究者从籼粳亚种间来源的染色体片代换系中，克隆了一个新的控制稻米粒长基因GS9。利用酵母双杂交文库，发现GS9能够与OsOFP14和OsOFP8相互作用；双荧光素酶报告进一步表明，OsOFP14反馈抑制GS9的表达；利用近等基因系及衍生的聚合系，证明GS9与其他已知粒形基因的表达互不影响，遗传分析证实GS9调控粒形的效应独立于GS3和GW5等已知基因。研究显示，该基因在高产水稻粒形和外观品质改良的分子育种中，具有很高的应用潜力，这项成果将为解决我国稻米质优高产难题提供重要的理论依据与技术支撑。（本文酵母文库由欧易生物提供技术服务）

图 | OFP与GS9互作并抑制其转录激活活性

研究结果
1.水稻染色体片段置换系CSSL N138具有和日本晴相同的粒重，但粒形更为细长。利用F3群体进行图位克隆，最终将这一基因锁定在9号染色体，并命名为GS9(Grain Shap Gene on Chromosome 9)。
2.携带有GS9基因的日本晴背景的近等基因系NIL-gs9同样具有更为细长的粒形。在利用CRISPR/Cas9技术敲除GS9的品系中，粒形表现为更细长；而在GS9过表达的品系中，表现为圆形籽粒。
3. NIL-gs9与日本晴小穗颖壳相比，横向细胞数量减少，但细胞大小增加。推测NIL-gs9粒形变得更为细长，是由于小穗颖壳中纵向细胞长度的增大和横向细胞数量减少导致的。
4.酵母双杂交文库筛选到GS9能够与OFP8/14相互作用。进一步发现，GSK2能够与OFP8互作。双荧光素酶报告实验证明OFP14/8能够抑制GS9的转录激活活性，并且这种抑制能被GSK2补救。OFP8受油菜素内酯信号通路关键因子OsGSK2激酶的磷酸化调控，而OsGSK2不能与GS9和OFP14互作。
5.为进一步研究GS9对基因表达的影响，对NIL-gs9和日本晴进行了转录组测序，结果显示GS9突变会导致一系列基因的变化，尤其是DNA结合和细胞分化相关基因。比较有意思的是，虽然上述研究表明GS9可以和OFP家族蛋白结合，但在RNA层面上，GS9的突变并未引起OFP基因的表达变化。
6.GW5和GS3是两个已经报道的可以控制水稻粒形的基因，为了研究它们与GS9之间的关系，将携带GW5、GS3的
NIL与NIL-gs9杂交，后代表现出更为细长的粒形，表明GS9、GW5、GS3对于粒形的决定具有加性效应；突变gs9对
于其他粒形决定基因没有影响，表明相互之间没有直接的关联。
7.通过多次回交将gs9导入WYJ8和WYJ27品系，或采用CRISPR/Cas9对Y8品系GS9基因进行编辑，子代均表现出更为细长的粒形。

参考文献
Zhao D S, Li Q F, Zhang C Q, et al. GS9 acts as a transcriptional activator to regulate rice grain shape and appearance quality.Nat Commun 2018; 9(1): 1240. (IF: 12.353).

案例二    Gateway体系——SPX1在大豆磷体内平衡过程中响应低磷胁迫

研究背景
磷是植物生长和新陈代谢所需的一种重要大量元素之一，对体内能量转化和蛋白质的激活具有重要作用。但截止目前，科学界对植物中磷信号途径了解很少。研究表明，含有SPX结构域的蛋白质对磷体内平衡和信号转导具有重要作用。在拟南芥中，SPX家族包含四个基因，水稻中包含6个基因。

研究内容
本文克隆了大豆全长SPX1序列，并对SPX1进行了功能分析。结果表明，SPX1对磷信号通路起到反馈抑制的作用，SPX1通过与MYB48互作参与低磷胁迫应答过程。（本文酵母文库由欧易生物提供技术服务）

图 | GmSPX1与GmMYB48相互作用

研究结果
1.基于拟南芥SPX基因序列进行同源比对，获取大豆基因组编码的十个SPX基因。进化分析表明，这十个基因都具有三个外显子和两个内含子，具有高度同源性。
2.定量PCR实验表明，经过低磷处理1天后，GmSPX1, 3, 5, 9, 10在根中表达量显著提高。而处理5天后，GmSPX1, 2, 4–6在叶片中以及GmSPX2, 4, 6, 8在根中表达显著上升。另外，处理10天后，GmSPX7–10在叶片中表达上升。所有SPX基因在补充磷元素1天后表达量得到恢复。
3.在拟南芥中过量表达大豆GmSPX1能够抑制低磷胁迫相关基因（AtPHT1-4, AtPHT1-5, AtACP5, AtRNS和 AtAT4）的表达。同时，在GmSPX1拟南芥同源基因AtSPX3的突变体中，相关基因的表达量上升。GmSPX1表明在磷信号通路起到负调控作用。
4.在野生型和atspx3突变体中过量表达GmSPX1，发现根毛伸长和根毛数量受到抑制。进一步检测根毛发育相关基因AtUBP14、AtPIP5K-1和AtPIP5K-3的表达量，证实上述基因下调表达。
5.通过酵母双杂交筛库实验，得到与GmSPX1互作的蛋白GmMYB48。并通过BiFC验证了二者的相互作用。
6.定量PCR实验表明，GmMYB48在低磷胁迫条件下表达量显著上升。其拟南芥同源基因AtMYB4在GmSPX1过量表达植株中下调表达。这个结果表明，GmSPX1对AtMYB4的表达起负调控作用。

参考文献
Zhang J, Zhou X, XuY,et al. Soybean SPX1 is an important component of the response to phosphate deficiency for phosphorus homeostasis.Plant Sci 2016; 248: 82-91. (IF: 3.607)