原位杂交（FISH）实验

原位杂交实验（FISH）是研究RNA表达、定位的常规实验技术手段。可以用于检测RNA表达，也可以用于在lncRNA

、circRNA等特殊RNA类型中的亚细胞定位研究。

原位杂交组织(或细胞)化学 (In situ Hybridization Histochemistry，ISHH) 简称原位杂交(In Situ Hybridization)，

属于固相分子杂交的范畴，它是用标记的DNA或RNA为探针，在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。

根据所用探针和靶 核酸的不同，原位杂交可分为DNA-DNA杂交，DNA-RNA杂交和RNA-RNA杂交三类。根据探针的

标记物是否直接被检测，原位杂交又可分为直接法 和间接法两类。

原位杂交可指示基因在细胞或组织环境中的表达位置。研究人员可使用带标记的 RNA 或 DNA 探针与样品中已知的靶

 mRNA 或 DNA 序列杂交，然后利用抗体检测探针上的标记检出这些带标记的 RNA 或 DNA 探针。因此，这些探针可

用于检测目标基因的表达水平和 mRNA 、lncRNA、miRNA、circRNA的位置。

样品保存
RNA 保存
RNase 酶的存在使 RNA 保存变得困难。此酶广泛存在于玻璃器皿上、试剂中以及操作人员身上及衣服上。RNase 可

迅速破坏细胞中的 RNA 及 RNA 探针本身，因此用户的实验过程、手套和溶液需要保证无菌，防止探针或组织 RNA 

受到 RNase 的污染。

冷冻切片的一般样品保存
为了使保存的载片获得结果，请勿将载片在室温环境下干燥保存。正确方法是，将其置于 100% 乙醇中-20 °C 

保存，或将其用莎伦包装膜覆盖的塑料盒在 -20 °C 或 -80 °C条件下保存。这种保存方法可使载片保存数年。

探针选择
RNA 探针

RNA 探针长约 250–1500 个碱基；长度为800 个碱基左右的探针具有灵敏度和特异性。转录模板应支持探针

（反义链）和阴性对照（正义链）RNA 的转录。将转录模板克隆至包含对生启动子的载体可实现这一目的。制备探

针之前，必须对环状模板进行线性化，但也可使用 PCR 模板。

DNA 探针

DNA 探针为原位杂交提供较高的灵敏度。与RNA探针相比， DNA 探针与靶 mRNA 分子的杂交强度较弱，因此在

杂交后的洗涤中不应使用甲醛。

探针特异性至关重要。如果已知细胞中 mRNA 或 DNA 的确切核苷酸序列，则可据此设计高度精确的互补探针。

如果超过 5% 的碱基对不互补，那么探针只能与靶序列发生轻度杂交。这意味着，探针更容易在洗涤和检测步骤

中被洗去，可能无法正确检测。

地高辛 (DIG) 标记 RNA 探针原位杂交实验方案

此方案介绍了如何使用 DIG 标记的 RNA单链 探针来检测石蜡包埋切片中目标基因的表达情况。

1) 脱蜡

对于冷冻切片，请从第 2 步开始操作。如果使用甲醛固定的石蜡包埋切片，请继续此步骤。

2) 抗原修复

将含 20 µg/mL 蛋白酶 K 的 50 mM Tris 预热并在 37 °C条件 下孵育酶解 10–20 分钟。孵育时间和蛋白酶 K 的浓

度可能需要根据实际情况优化。

3) 使用蒸馏水清洗载片 5 次。

4) 将载片浸入预冷的 20% (v/v) 乙酸中 20 秒。这样可使细胞通透化，使探针或抗体能够透过。

5) 分别使用 70% 乙醇、95% 乙醇和 100% 乙醇洗涤载片（每次约 1 分钟）使其脱水，然后风干。

6) 向每个载片中加入 100 µL 杂交液。 

7) 将载片置于所需杂交温度下的增湿杂交盒中孵育 1 小时。杂交温度的范围通常为 55–62 °C。

8) 在PCR 管中用杂交液稀释探针。利用PCR仪在 95 °C条件下加热RNA 或 DNA 2 分钟，使其变性。然后立即将探

针置于冰上冷却，以防止重退火。

9) 除去杂交液。向每个切片加入 50–100 μL 探针稀释液，覆盖整个样品。在 65 °C 条件下在增湿的杂交盒中孵育

过夜。用盖玻片盖住样品，以防样品蒸发。

在此步骤中，RNA 探针会与相应的 mRNA 杂交，或 DNA 探针会与相应的细胞 DNA 杂交。杂交温度的优化取决于所

用的探针序列以及细胞或组织类型。所分析的每种组织类型都需进行杂交温度的优化。

探针的杂交温度取决于靶序列中碱基的百分比含量。序列中胞嘧啶和鸟嘌呤的比例是关键因素。

10) 严格洗涤：通过调节温度、盐浓度和洗涤剂浓度等溶液参数可消除非特异性相互作用。

11) 在室温下使用 MABT（含 Tween 20 的马来酸缓冲液）洗涤两次，每次 30 分钟。MABT 的性质比 PBS 更温

和，更适用于核酸检测。 

12) 干燥载片。

13) 将其转移至增湿盒中，向每个切片加入 200 µL 封闭缓冲液（MABT + 2% BSA，牛奶或血清）。在室温下封闭

 1–2 小时。

14) 去除封闭缓冲液。将抗标记抗体以所需稀释度加入封闭缓冲液。查看抗体说明书中推荐的浓度/稀释度。在室温下

孵育 1–2 小时。

15) 在室温下使用 MABT 洗涤载片 5 次，每次 10 分钟。

16) 在室温下使用预染色缓冲液（100 mM Tris pH 9.5，100 mM NaCl，10 mM MgCl2）洗涤载片 2 次，每次 

10 分钟。

17) 如需进行荧光检测，请跳至第 18 步。对于其他形式的检测，请将载片放回增湿盒中，然后依照厂家说明书

使其显色。

18) 使用蒸馏水清洗载片。

19) 将载片风干 30 分钟。然后使用 100% 乙醇进行洗涤，并将其彻底风干。

20) 使用 DePeX 封片溶液进行封片。