CRISPR-dCas9基因表达调控

CRISPR-dCas9基因表达调控

一、原理及应用介绍

     CRISPR/Cas9系统是目前被广泛运用的基因编辑系统，其原理是由CRISPR转录产生的sgRNA介导Cas9核酸酶靶向目标序列，对序列进行切割。Cas9的核酸酶剪切活性取决于两个结构域：RuvC和HNH。当这两个结构域同时处于失活状态时，Cas9将不具有核酸酶活性，成为dCas9(dead Cas9)。CRISPR-dCas9系统即是dCas9与转录激活因子（如VP64、VPR、SAM或SunTag）或转录抑制因子（如KRAB）融合后，结合sgRNA能促进或抑制目的基因的表达。

图1. CRISPR-dCas9系统调控内源基因的转录激活与抑制（Gilbert LA,et al.,Cell,2013）

应用领域

CRISPR-dCas9转录激活：可实现目的基因在内源环境中过表达、诱导iPSC、激活沉默基因、遗传缺陷补偿等；

CRISPR-dCas9转录抑制：可实现抑制目的基因表达、分析代谢途径、敲低特定基因转录量以研究基因功能、可与CRISPR/Cas9 Gene Knockout或RNAi技术联合作用等。

应用案例

1.基因敲低（CRISPRi）和基因敲除（CRISPRn）效率的比较

     Mandegar等人通过比较Tet-on调控dCas9-KRAB的基因敲低（CRISPRi）与Tet-on调控Cas9的基因敲除（CRISPRn），发现CRISPRi对NANOG的抑制效果更快且更完全。主要是由于CRISPRn的敲除存在很大的效率问题，在iPS细胞系中NANOG受抑制的仅60%–70%的细胞，而CRISPRi能达到99%以上。

图2. 基因敲低（CRISPRi）和基因敲除（CRISPRn）效率的比较（Mandegar MA,et al.,cell stem cell,2016,modified）

2.dCas9-VPR能显著提高内源性基因的表达

     Chavez等人将dCas9与三种激活因子VP64-P65-Rta（VPR，VP64：疱疹病毒转录因子，P65：NFкB信号通路的成员，Rta：EB病毒激活因子）融合，通过特异性靶向目的基因的sgRNA能特异性的提高内源性基因（MIAT, NEUROD1, ASCL1和RHOXF2）的转录水平，起到激活基因的目的。与dCas9-VP64相比效果更加显著。

图3. dCas9-VPR能显著提高内源性基因的表达（Chavez A,et al.,Nature methods,2015）

二、我司提供病毒载体及细胞系构建服务

服务内容

1. sgRNA的设计；

2. 细胞内sgRNA剪切活性检测；

3. 依据不同需求选择不同载体的构建：

     a、CRISPR-dCas9转录激活载体的构建：sgRNA-dCas9-VP64/VPR表达质粒

     b、CRISPR-dCas9转录抑制载体的构建：sgRNA-dCas9-KRAB表达质粒

4. 依据所要编辑的细胞选择不同导入方式：

     a、脂质体易转染细胞：使用质粒系统

     b、脂质体难转染细胞：使用质粒系统电转化、慢病毒或腺相关病毒感染

5. RT-PCR检测目的基因的转录水平。

服务流程

需客户提供内容/材料

1、目的基因序列（基因ID）以及物种来源；

2、需介导转录激活或抑制的细胞（可选）；

3、病毒类型选择以及要求；

4、血清型选择。

表1.服务信息及最终交付内容、产品

声明：枢密科技提供的所有基因编辑服务及该服务的后续研究，仅适用在国家法律和伦理规范的范围内实施。禁止用于任何人体或临床实验的研究；禁止用于对人类生殖体系进行基因修饰的研究；禁止将基因修饰的其他动物胚胎及生殖细胞植入人体。客户如违反相关法律规定，本公司不承担任何法律责任。