神经递质探针类、钙离子探针类神经干细胞

神经递质探针类、钙离子探针类神经干细胞

一、神经干细胞原理及应用

     神经干细胞(Neural Stem Cells,NSCs)是能够自我更新，并且具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞等多项分化潜能的细胞。发育过程中，NSCs存在于神经管，随后逐渐进入室管膜下区、纹状体和海马中。科学界曾认为，只有胚胎发育阶段才会产生新的神经元。后来大量研究表明，成年哺乳动物脑中也存在NSCs，主要分布于海马齿状回下层颗粒(subgranular zone,SGZ)和侧脑室室管膜下区(subventricular zone,SVZ)。在整个生命周期中，不断有新的神经元产生；大脑受到损伤时，一些休眠的NSCs将被激活。

     NSCs可修复受损的神经系统，移植的NSCs又趋向于定植病灶部位，在神经系统再生治疗领域拥有广阔的前景。然而NSCs数量极少，取材又极其困难，从胚胎干细胞诱导分化获取NSCs又受到伦理限制。好在随着重编程技术的发展，现已实现从成体细胞直接重编程为NSCs，或从诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs)分化得到大量NSCs，使得NSCs移植能够真正进入临床应用。

图1.神经干细胞特性。神经干细胞能够分泌神经营养因子、生长因子和细胞因子来保护神经系统；神经干细胞分化为神经元或胶质细胞前体细胞，再分化为神经元或胶质细胞来代替神经系统中丢失的细胞，在神经损伤修复中起到重要作用。（图片改自Tang Y,et al.,Cell Death Dis.2017.）

神经干细胞应用

细胞治疗

     神经干细胞研究在神经退行性疾病、脊髓损伤、脑卒中、脑瘫、癫痫、外伤性脑损伤等多种神经疾病中取得了重大进展。有许多研究报道，NSCs移植到脑梗死、脊髓损伤、阿尔茨海默病等神经疾病动物模型，在损伤处分化形成新的神经元或胶质细胞，分泌多种营养因子，有效改善病情且未发现肿瘤形成。

基因治疗载体

     神经干细胞拥有定植于疾病或损伤区的能力，这种“亲病灶性”使得NSCs可以作为基因和药物治疗的载体。对NSCs进行基因修饰，使其分泌特定的因子，并输送到损伤部位。有研究发现，基因工程修饰的NSCs移植后可以分泌药物前体激活胞嘧啶脱氨酶活化酶，缩小裸鼠髓母细胞瘤的瘤块。

药物研发及其他科研应用

     药物研发领域，神经干细胞(或分化后神经元/胶质细胞)可作为药物筛选、药效验证、毒性测试的细胞模型；在基础研究领域，由各种基因修饰神经干细胞构成的工具细胞库，是体内、体外研究神经干细胞治疗分子/细胞/神经环路机制和生理过程的前沿技术和系统工具。

图2.神经干细胞应用

二、产品介绍

     枢密研发的基因修饰神经干细胞系，是通过基因工程技术，对神经干细胞进行遗传修饰，使其稳定表达特定的外源基因，如荧光蛋白、神经递质探针、钙离子探针、光敏感蛋白等，实现对细胞进行实时观察与精确操纵，应用于电生理、光遗传学、神经回路示踪等多种领域。同时，枢密可提供神经干细胞定向分化培养基，可将神经干细胞分化为感兴趣的神经细胞类型，为客户提供更加便捷的实验条件，提高实验的可重复性。

图3.基因修饰神经干细胞产品应用

神经递质探针类神经干细胞

     大脑复杂功能的实现离不开神经元之间高效特异的信息交流和整合，神经递质作为重要的生物小分子，参与了神经元间化学突触介导的信息传递过程。

     传统的直接测量法无法实现单个细胞水平的递质检测，且特异性不够高，时间和空间精度也较差。新型探针GRAB(GPCR Activation Based Sensor)可以实时精确地检测神经递质的动态变化，灵敏度高，特异性高，分辨率高，用于在高时间和空间尺度上解析神经系统的复杂功能。

图4.GRAB探针原理示意图。将循环重排荧光蛋白插入到G蛋白偶联受体(GPCR)与配体(神经递质)结合后构象改变最显著的区域，形成融合蛋白。一旦特定的神经递质激活GPCR使其构象改变，与之相连的荧光蛋白的构象也发生改变，荧光强度发生变化，从而指示神经递质浓度的动态变化。(图片修改自Jing M,et al.,Nat.Biotechnol.2018)

图5.表达乙酰胆碱探针(GACh2.0)的皮质神经元。实验组在浴液中加入100μM乙酰胆碱(ACh),共聚焦显微镜记录绿色荧光变化。(图片修改自Jing M,et al.,Nat.Biotechnol.2018)

神经递质探针类神经干细胞产品

钙离子探针类神经干细胞

     利用可以感应Ca2+浓度的指示剂，将钙浓度变化转化为荧光信号。钙离子指示剂分为两种，一种为化学指示剂，另一种为现在普遍使用的遗传编码指示剂，例如GCaMP，其原理如下图所示(图6)。

     钙离子成像技术广泛应用于神经生物学，细胞生物学，生理学，发育生物学和药物学领域中。其中，神经生物学中主要研究神经细胞离子浓度改变引发的信号发射，通过记录被GFP标记到的神经细胞发光的有无和强弱判断神经细胞活动。

图6.GCaMP探针原理示意图。GCaMP由循环重排绿色荧光蛋白(cpGFP)、钙调蛋白(CaM)和肌球蛋白轻链激酶的一段肽段序列M13构成。当Ca2+结合CaM时，CaM构象改变，其铰链区结合M13，使cpGFP在特定波长的光照下其发色团质子化作用增强，吸光度增加而发出强烈荧光。(图片修改自Lindenburg L,Merkx M.Sensors (Basel）.2014.)

图7.表达钙离子探针的海马神经元。激活指示剂后300s，荧光信号充满了整个细胞，包括树突和树突棘。（图片引自Berlin S,et al.,Nat Methods.2015.）

钙离子探针类神经干细胞产品