SAM文库强效激活转录 ——全基因组获得性功能的筛选

SAM文库可强特异性激活基因组中编码基因的转录，用于在人类细胞中进行功能获得性筛选。 CRISPR/Cas9协同转录激活调节子（SAM）是一种设计的蛋白复合物，能够强效激活内源性基因的转录。失活的Cas9核酸酶通过gRNA靶向于基因组中的特异性位点。SAM复合物包含3个转录激活结构域-VP64,P65和HSF1，可靶向于转录起始位点上游200bp位点，从而起到协同加强下游基因转录的作用。SAM使用失活的Cas9以确保不造成内源基因组的链断裂。人全基因组SAM文库可激活RefSeq数据库 (23,430亚型)中的所有已知的编码亚型，以用于功能获得性的筛选。SAM文库已经被广泛使用于原代的小鼠，人细胞，干细胞，癌细胞及各种稳定细胞系。SAM文库筛选允许客户在不同条件下鉴定任何细胞存活必须的基因，以及那些因为激活使癌细胞产生耐药性的基因。如需了解关于SAM文库设计&构建的完整信息，可查看文献：Konermann S*, Brigham MD*, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N, Gootenberg JS, Nishimasu H, Nureki O & Zhang F. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature, doi:10.1038/nature14136.

SAM文库内容

• 70,290 gRNA序列；靶向人类基因组中23,430个不同的编码亚型，每3条sgRNA序列即靶向1个编码亚型

• Human SAM 文库克隆至pLenti sgRNA(MS2)_zeo载体

• 另随文库附上lenti dCas9-VP64_Blast及lenti MS2-P65-HSF1_Hygro两个质粒。

SAM文库交付

⁺ 文库以25 μg为单位交付；4 x 25 μg（100 μg 文库）或8 x 25 μg （200 μg 文库）；*交付周期为工作日；**需求量可以100 µg为单位向上增加。

如何使用SAM文库，用于功能获得性的筛选

SAM文库是CRISPR gRNA 混合文库，直接靶向基因组每一个转录起始位点的上游。

对于SAM 功能获得性的筛选，人全基因组的SAM sgRNA文库需与另外两个SAM元件结合，即dCas9-VP64 与MS2-P65-HSF1，这三个SAM元件共同转导入细胞中。为适于共转导及筛选，三个慢病毒载体都有各自的抗性标记。三个元件都是以慢病毒载体形式交付，且病毒载体都是经过优化的，能够复制高滴度，以有效转导原代细胞或培养细胞系。SAM 文库以较低的MOI值转导到细胞群中，以保证每个细胞进入不超过1条gRNA。转导完成后在进行文库筛选之前，应对细胞进行NGS深度测序，以评估gRNA在细胞中的表现。筛选完成后，进行第二轮NGS测序并数据分析，用于鉴定筛选过程中丢失或富集的gRNA。为了筛选到SAM文库中的阳性克隆，您需对多个富集gRNA的基因进行鉴定。更多SAM筛选流程，请参考SAM/Genome Engineering网站。

SAM 文库构成

SAM复合物由三部分构成：

• 核酸酶活性失活的Cas9-VP64融合蛋白

• sgRNA，其形成的茎环部分包含了两个MS2 RNA适配子

• MS2-P65-HSF1激活辅助蛋白

三个不同的激活结构域- VP64, P65 and HSF1， 协同激活转录

三个元件都由单独的慢病毒载体编码。 所有三个载体必须共转染进细胞才能使得SAM发挥作用 人全基因组的SAM gRNA文库序列可点击这个.csv文件中获取

SAM文库载体

我们交付的SAM文库是一个混合文库，包含：sgRNA克隆到gRNA慢病毒表达载体，以及需要共同转导的dCas9-VP64 和 MS2-p65-HSF1慢病毒表达载体。