固体即溶型CCK-8试剂盒

中文名：固体即溶型CCK-8试剂盒

英文名：Solid instant dissolution Cell Counting Kit-8

货号：S707171

存储温度：室温

产品介绍：

细胞活力和细胞毒性测定通常用于药物筛选和化合物细胞毒性测试。CCK-8试剂盒使用高度水溶性的四氮盐 (称为WST-8) 来产生适用于细胞增殖和细胞毒性测定的水溶性WST-8甲攒。与MTT不同，WST-8和WST-8甲攒在细胞培养基中没有细胞毒性，因此可以使用同一检测板进行多个下游实验。 CCK-8法是一种便捷的比色测定法，用于测定细胞活力，无需增溶过程，只需最少的步骤即可提供结果。CCK-8法可用于96孔微孔板测定以及高通量筛选384孔微孔板测定。 

优势：

目前市售液体型CCK-8试剂盒普遍存在贮存条件苛刻(-4C或-20)，在不同pH范围下使用不稳定，易变质(变色或产生沉淀)等缺陷。固体即溶型CCK-8试剂盒采用全新配方，瑞士工艺，克服了液体型CCK-8试剂盒的这些缺点，可以在室温下长期保存(>3年)，即开即用，在宽pH范围内稳定，实验结果更可靠。与液体型CCK-8试剂盒相比，固体即溶型CCK-8试剂盒的灵敏度更高，生物响应时间缩短一半。

应用范围：
可用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测。 

操作说明：

本试剂盒可以用于药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验以及生物因子的活性检测。 

1.沿包装袋缺口处小心缓慢撕开；
2.将袋内粉末全部倒入装有10mL超纯水的干净容器中,持 续摇晃1分钟,当固体完全溶解后即可使用；
3.未使用完的试剂务必在4℃以下低温保存。

检测所需设备：
带有 450 - 490 nm 过滤器的酶标仪96孔板；
二氧化碳培养箱；
96 孔板，用于细胞检测的灭菌透明板；
多通道移液器（8 或 12 通道：10-100 µl）；
血细胞计数器或细胞计数器。
细胞活性检测：
1. 在96孔板中接种细胞悬液 (100 μl/孔), 将培养板放在二氧化碳培养箱中预培养24小时 (37℃, 5% CO2)；
2. 向每孔加入10 μl CCK-8溶液 (注意不要在孔中生成气泡，会影响OD值的读数)；
3. 将培养板在培养箱内孵育1-4小时；
4. 用酶标仪测定在450 nm处的吸光度；
5. 若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μl 0.1M的HCI溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
细胞增殖-毒性检测：
1. 在96孔板中接种细胞悬液 (100μl/孔), 将培养板放在培养箱预培养24小时 (37℃, 5% CO2)；
2. 向培养板加入10ul不同浓度的待测物质；
3. 将培养板在培养箱孵育一段适当的时间 (例如: 6、12、24或48小时);
4. 向每孔加入10 μl CCK-8溶液 (注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD值的读数);
5. 将培养板在培养箱内孵育1-4小时;
6. 用酶标仪测定在450nm处的吸光度;
7. 若暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10 μl 0.1M的HCI溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。24小时内测定，吸光度不会发生变化。
细胞存活率/抑制率计算方法：
细胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]x100%
抑制率=[(Ac-As)/(Ac-Ab)]x100%
As:实验孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8溶液和药物溶液);
Ac:对照孔吸光度 (含细胞、培养基、CCK-8溶液，不含药物);
Ab:空白孔吸光度 (含培养基、CCK-8溶液，不含细胞、药物)。
注意事项： 

1. 未使用完的试剂务必在4℃以下低温保存，拆封后在-20°C避光保存两年，尽量避免反复解冻； 

2. CCK-8的培养时间一般为1-4小时，但在培养30分钟左右即可取出肉眼观察显色程度，根据细胞种类而定，需要摸索条件，CCK-8 的最佳反应时间以具体显色的最佳时间为准。建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间 ； 

3. 本试剂盒中的WST-8会与还原剂（例如一些抗氧化剂) 反应，从而干扰检测。在细胞增殖-毒性检测前可通过检查背景OD 来确认待检测物质中是否有还原剂。如需去除还原剂影响，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基 (除去培养基, 并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基)； 

4. 培养基中的酚红不会影响实验结果，酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响. 

5. 建议采用多通道移液器，以减小平行孔间的差异。加入CCK-8试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，会干扰OD测定； 

6. 加入药物中如含有金属，对CCK-8显色有影响。终浓度为1mM 的氯化亚铅、氯化铁、硫酸铜会抑制5%、15%、90%的显色反应，使灵敏度降低。如果终浓度是10mM的话，将会100% 抑制显色反应； 

7. 使用96孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，要注意蒸发问题。一方面，由于 96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加相同量的PBS、水或培养液;另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发； 

8. 当使用标准96孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000个/孔 (100 μl培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500个/孔 (100 μl培养基)。如果要使用24孔板或6孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液； 

9. 细胞培养时间依细胞的种类和数量（每孔）而不同，通常白细胞显色较弱，需要较长的培养时间（4小时）和大量细胞（~105细胞/孔)； 

10. CCK-8试剂对细胞的毒性非常低。它和活细胞内的脱氢酶持续反应使溶液颜色不断加深，OD值不断增加。以下方法可以终止CCK-8反应(96孔板): a) 在显色反应后，将培养板放置4°C冰箱内；b) 每孔加10μL 0.1MHCl溶液; c) 每孔加10 μL 1%(w/v)的SDS (十二烷基硫酸钠) 溶液。反应停止后，应在24小时内测定OD值； 

11. 要测定细胞的具体数量，建议同时做标准曲线。 

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