UltraBio™6000转染试剂

中文名：UltraBio™6000转染试剂

英文名：UltraBio™6000 Transfection Reagent

货号：T751607

存储温度：-20°C储存

产品介绍：

UltraBio™6000转染试剂(UltraBio™6000 Transfection Reagent)是一种非常高效的新型转染试剂，达到了国际最主流转染试剂的转染效果。适用于把质粒、siRNA或其它形式的核酸包括DNA、RNA、寡核苷酸、以及核酸蛋白复合物或带负电荷的蛋白转染到真核细胞中，也可以用于活体动物的核酸转染以用于基因治疗。UltraBio™6000转染试剂对于常见的哺乳动物细胞具有非常高的转染效率、重复性好、操作简单、无明显的细胞毒性，并且对于贴壁细胞和悬浮细胞都适用。贴壁细胞转染试剂的比较和选择请参考：http://www.aladdin-e.com。UltraBio™6000转染试剂的使用方法和常用的UltraBio™2000Reagent基本一致。并且经过对HEK293T、Hela、NIH3T3、HEK293FT、CHO等细胞的测试，转染效率也和UltraBio™2000Reagent相当甚至略高。UltraBio™6000转染试剂不仅适用于质粒、siRNA等单一成分的细胞转染，也适合多个质粒或者质粒与siRNA等的组合转染。UltraBio™6000转染试剂转染过表达质粒后，通常24-48小时后达到较高的蛋白表达水平，并且很多情况下蛋白表达量在转染后48小时显著高于转染后24小时；转染siRNA通常3-5天后对于目的基因的下调水平会比较理想。UltraBio™6000转染试剂转染细胞时，基本不受细胞培养液中的血清和抗生素的影响，即可以在血清和抗生素存在的情况下进行细胞转染。但为了取得最佳的转染效果，推荐转染时使用不含抗生素的含血清的细胞培养液。UltraBio™6000转染试剂的转染效果可以通过转染表达EGFP等荧光蛋白的质粒进行快速鉴定。UltraBio™6000转染试剂与UltraBio™2000Reagent转染效果比较请参考图1-6。对于六孔板，一个包装的C0526-0.5ml、C0526-1.5ml和C0526-7.5ml转染试剂大约可以分别转染100个、300个和1500个孔；对于24孔板，一个包装的C0526-0.5ml、C0526-1.5ml和C0526-7.5ml转染试剂大约可以分别转染500个、1500个和7500个孔。

注意事项：

使用高纯度的DNA或RNA有助于获得较高的转染效率。对于质粒，可以使用阿拉丁生产的质粒大量抽提试剂盒进行抽提，以保证可以获得较高的转染效率。转染前细胞必须处于良好的生长状态。需自备不含抗生素的无血清培养液或Opti-MEM?培养液或普通的DMEM培养液。Lipo6000?转染试剂不能vortex或离心，宜缓慢晃动混匀。Lipo6000?转染试剂使用后请立即盖好盖子，避免长时间暴露在空气中，影响转染效率。本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。\t'],

使用说明：

1.DNA转染：a.细胞培养(以六孔板为例，其它培养板或培养皿可参考六孔板)：在转染前一天(18-24小时)按照每孔约20-70万细胞(具体的细胞数量据细胞类型、大小和细胞生长速度等而定)接种到六孔板内进行培养，使第二天细胞密度能达到约70-90%。b.在进行下述转染步骤前，把培养有细胞的六孔板每孔换成2ml新鲜培养液(含有血清，不含抗生素)。可以使用含有血清并含有抗生素的新鲜培养液，但抗生素的存在对于有些细胞容易导致转染后出现一定的细胞毒性。c.参考下表，对于待转染的六孔板中每一个孔的细胞，取两个洁净无菌离心管，分别加入125μl不含抗生素和血清的DMEM培养液(高糖DMEM或低糖DMEM均可)或Opti-MEM® Medium，然后于其中一管加入2.5μg质粒DNA，并用枪轻轻吹打混匀；另一管加入5μl Lipo6000™转染试剂，用枪轻轻吹打混匀，请特别注意不可Vortex或离心。室温静置5分钟后(通常最长不宜超过25分钟)，将含有DNA的培养液用枪轻轻加入含Lipo6000™转染试剂的培养液中，轻轻颠倒离心管或者用枪轻轻吹打混匀，室温静置5分钟(室温存放6小时内稳定)。96-well48-well24-well12-well6-well 6cm dish10cm dishLipo6000™转染试剂0.2μl 0.5μl 1μl 2μl 5μl 10μl 30μl 无血清培养液或Opti-MEM® Medium5μl 12.5μl 25μl 50μl 125μl 250μl 750μl DNA100ng 250ng 500ng 1μg 2.5μg 5μg 15μg 无血清培养液或Opti-MEM® Medium5μl 12.5μl 25μl 50μl 125μl 250μl 750μl 稀释好的Lipo6000™转染试剂和DNA分别室温静止放置5分钟，随后两者混合并混匀再室温静止放置5分钟每孔加入的混合物的量10μl 25μl 50μl 100μl 250μl 500μl 1500μl 按照上述用量每孔均匀滴加Lipo6000™转染试剂和DNA的混合物，4-6小时后更换培养液或直接继续培养注1：对于六孔板中一个孔的细胞，Lipo6000™转染试剂的用量可以在3-12.5μl范围内进行适当调节，DNA用量建议固定在2.5μg，但也可以在1-4μg的范围内进行适当调节。通常质粒用量(μg)和Lipo6000™(μl)的用量比例为1:2或1:3比较常用，如有必要可以在1:0.5-1:5的范围内优化转染效果，上表推荐的比例为1:2，此时Lipo6000™的用量相对较少，既经济又高效。最佳的转染条件，因不同的细胞类型和培养条件而有所不同，可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。注2：质粒的浓度宜控制在0.5-5μg/μl范围内。注3：对于多个孔转染相同数量相同质粒的情况可以把每个孔所需的Lipo6000™转染试剂和DNA混合物分别配制，然后一起混合在同一个离心管内，后续混匀并孵育5分钟后，可以按照推荐用量滴加到细胞培养器皿内。注4：对于其它培养板或培养器皿，各种试剂的用量可以按照细胞培养器皿的培养面积按比例进行换算。如果转染寡核苷酸或RNA等可以参考转染DNA的条件进行。d.无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，按照六孔板每孔250μl Lipo6000™转染试剂-DNA混合物的用量，均匀滴加到整个孔内，随后轻轻混匀。e.为达到最高的转染效率，细胞在转染后培养4-6小时后宜更换为新鲜的完全培养液(对于Hela细胞，推荐在转染4小时后更换培养液，对于NIH3T3、CHO、HEK293T和HEK293FT细胞，推荐在转染6小时后更换培养液)。f.继续培养约24-48小时后，即可用适当方式检测转染效果，例如荧光检测、Western、ELISA、报告基因等，或加入适当的筛选药物如G418等进行稳定细胞株的筛选。2.siRNA转染：a.细胞培养(以六孔板为例，其它培养板或培养皿可参考六孔板)：在转染前一天(18-24小时)按照每孔约20-70万细胞(具体的细胞数量据细胞类型、大小和细胞生长速度等而定)接种到六孔板内进行培养，使第二天细胞密度能达到约30-50%。b.在进行下述转染步骤前，把培养有细胞的六孔板每孔换成2ml新鲜培养液(含有血清，不含抗生素)。可以使用含有血清并含有抗生素的新鲜培养液，但抗生素的存在对于有些细胞容易导致转染后出现一定的细胞毒性。c.参考下表，对于待转染的六孔板中每一个孔的细胞，取两个洁净无菌离心管，分别加入125μl不含抗生素和血清的DMEM培养液(高糖DMEM或低糖DMEM均可)或Opti-MEM® Medium，然后于其中一管加入100pmol siRNA，并用枪轻轻吹打混匀；而另一管加入5μl Lipo6000™转染试剂，用枪轻轻吹打混匀，请特别注意不可Vortex或离心。室温静置5分钟后(通常最长不宜超过25分钟)，将含有siRNA的培养液用枪轻轻加入含Lipo6000™转染试剂的培养液中，轻轻颠倒离心管或者用枪轻轻吹打混匀，室温静置5分钟(室温存放6小时内稳定)。96-well48-well24-well12-well6-well 6cm dish10cm dishLipo6000™转染试剂0.2μl 0.5μl 1μl 2μl 5μl 10μl 30μl 无血清培养液或Opti-MEM® Medium5μl 12.5μl 25μl 50μl 125μl 250μl 750μl siRNA4pmol10pmol20pmol40pmol100pmol 200pmol600pmol无血清培养液或Opti-MEM® Medium5μl 12.5μl 25μl 50μl 125μl 250μl 750μl 稀释好的Lipo6000™转染试剂和siRNA分别室温静止放置5分钟，随后两者混合并混匀再室温静止放置5分钟每孔加入的混合物的量10μl 25μl 50μl 100μl 250μl 500μl 1500μl 按照上述用量每孔均匀滴加Lipo6000™转染试剂和siRNA的混合物，4-6小时后更换培养液或直接继续培养注1：对于六孔板中一个孔的细胞，Lipo6000™转染试剂的用量可以在2.5-7.5μl范围内进行适当调节，siRNA用量可以在50-250pmol的范围内进行适当调节。通常siRNA用量(pmol)和Lipo6000™(μl)的用量比例为20:1，如有必要可以在10:1-40:1的范围内优化转染效果，上表推荐的比例为20:1，此时Lipo6000™的用量相对较少，既经济又高效。最佳的转染条件，因不同的细胞类型和培养条件而有所不同，可以在上述推荐范围内自行优化转染条件。注2：siRNA的推荐浓度为20μM，常用的浓度范围为10-50μM。注3：对于多个孔转染相同数量相同质粒的情况可以把每个孔所需的Lipo6000™转染试剂和siRNA混合物分别配制，然后一起混合在同一个离心管内，后续混匀并孵育5分钟后，可以按照推荐用量滴加到细胞培养器皿内。注4：对于其它培养板或培养器皿，各种试剂的用量可以按照细胞培养器皿的培养面积按比例进行换算。如果转染寡核苷酸或RNA等可以参考转染DNA的条件进行。d.无论是贴壁细胞还是悬浮细胞，按照六孔板每孔250μl Lipo6000™转染试剂-siRNA混合物的用量，均匀滴加到整个孔内，随后轻轻混匀。e.为达到最高的转染效率，细胞在转染后培养4-6小时后宜更换为新鲜的完全培养液(对于Hela细胞，推荐在转染4小时后更换培养液，对于NIH3T3、CHO、HEK293T和HEK293FT细胞，推荐在转染6小时后更换培养液)。f.继续培养3-5天后，即可用适当方式检测siRNA对于靶基因的下调效果，例如qPCR、Western、ELISA、报告基因等。常见问题：1.转染效率低：a.优化质粒与Lipo6000™转染试剂比例，对于难转染的细胞，可适当加大质粒用量。b.应用高纯度、无菌、无污染物的质粒进行转染，DNA纯度方面A260/A280比值要接近1.8，通常宜控制在1.8-1.9范围内，偏低则有可能有蛋白污染，偏高则有可能有RNA污染。可以使用阿拉丁生产的质粒大量抽提试剂盒 进行抽提，以保证可以获得较高的转染效率。c.贴壁细胞转染时状态良好，细胞密度达30-50%时才可进行转染，过稀可能影响转染效率，细胞密度达到50-90%时通常不会影响转染效率。不同细胞的最佳转染密度需要自行摸索。悬浮细胞 宜在对数生长期进行转染。d.需使用无抗生素和无血清培养液配制Lipo6000™转染试剂和质粒或siRNA等的混合物。e.转染后培养时间不足，而被误以为转染效率偏低。不同细胞转染后至显著表达所需要培养的时间通常为24-48小时。f.检查细胞是否有支原体感染，支原体感染会影响细胞增殖，并很可能影响转染效率。g.如果没有检测到目的蛋白表达，应该仔细核对转染质粒的测序结果，确保测序结果和读码框完全正确。h.如果靶基因的敲减(knockdown)效果欠佳，应该考虑尝试设计不同的siRNA。2.细胞毒性较大：a.缩短转染时间，在转染后较短时间内更换新鲜的细胞培养液。b.减少质粒用量，按照比例减少Lipo6000™转染试剂。c.检查是否转染时细胞密度太低。附录：常用多孔板和培养皿的尺寸、培养面积、细胞培养量和推荐的培养体积等相关数据表：Multiple Well Plates or DishesSingle Well Only for PlatesDiameter (Bottom, mm)*Growth Area(cm2)*Average Cell YieldTotal Well Volume (ml)WorkingVolume (ml)Recommended Volume (ml)6 well34.89.59.5 × 105 16.81.9-2.9212 well22.13.83.8 × 105 6.90.76-1.14124 well15.61.91.9 × 105 3.40.38-0.570.548 well11.00.959.5 × 104 1.60.19-0.2850.2596 well6.40.323.2 × 104 0.360.10-0.200.1384 well2.70.0565.6 × 103 0.1120.025-0.0500.0301536 well1.63 × 1.63**0.0252.5 × 103 0.01250.005-0.0100.0103.5 cm dish3499.0 × 105 NA1.8-2.726 cm dish52212.1 × 106 NA4.2-6.3510 cm dish8.4555.5 × 106 NA11-16.51215cm dish141521.5 × 107 NA30.4-45.63524.5cm dish22.4 × 22.4**5005.0 × 107 NA100-150120*Diameter and growth area may vary depending on the manufacturer, and the listed sizes are from Corning. **These wells or dishes are square.

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