Uracil-DNA Glycosylase (E. coli)，不含UDG酶活力之外的内切或外切脱氧核糖核酸酶、RNase和磷酸酶活性。

中文名：Uracil-DNA Glycosylase (E. coli)

英文名：Uracil-DNA Glycosylase (E. coli)

纯度：不含UDG酶活力之外的内切或外切脱氧核糖核酸酶、RNase和磷酸酶活性。

货号：U751665

存储温度：-20°C储存

产品介绍：

阿拉丁生产的Uracil-DNA Glycosylase (E. coli)，也称E. coli Uracil-DNA Glycosylase (UDG)或E. coli Uracil N-Glycosylase (UNG)，即大肠杆菌UDG或UNG，可催化含尿嘧啶的DNA链中的尿嘧啶(dU)碱基和脱氧核糖之间的N-糖苷键发生水解，从而释放游离尿嘧啶。Uracil-DNA Glycosylase (UDG)可以水解含有dU的单链或双链DNA，但不能水解RNA或含有dU的长度不超过6个碱基DNA寡聚体。UDG主要应用于消除PCR扩增过程中带来的产物污染问题。其防止污染的原理为：在PCR反应中加入适量的dUTP，以dUTP替代dTTP掺入DNA中，形成含dU碱基的PCR扩增产物；后续进行PCR反应时，使用UDG酶选择性切割可能被污染而带入的之前PCR扩增产生的含有dU的单链或双链DNA，从而避免之前的PCR扩增产物可能的污染对于本次PCR扩增带来的负面影响。活性定义：One unit is defined as the amount of enzyme that catalyzes the release of 60 pmol of uracil per minute from double-stranded, uracilcontaining DNA. Activity is measured by release of 3H]-uracil in a 50 µl reaction containing 0.2 µg DNA (104–105 cpm/µg) in 30 minutes at 37℃.阿拉丁生产的E. coli UDG酶活性鉴定结果可参考图1。图1.阿拉丁和N公司E. coli UDG酶催化水解5µl含dU碱基的PCR扩增产物效果图。使用本产品或国外N公司的E. coli UDG，在20µl体系，分别以5µl含dU碱基的1600bp大小的PCR扩增产物为底物和不同量的(0U, 0.0025U, 0.005U, 0.01U, 0.025U, 0.5U) E. coli UDG在1X E. coli UDG Buffer，37℃孵育30min，然后用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。如图所示，本产品与N公司相比，具有相当的酶活。M, DNA marker )。

用途：

防止PCR产物的交叉污染；单核苷酸多态性检测(single nucleotide polymorphism detection，GMPD)；位点特异性突变；蛋白质与DNA相互作用研究；SNP基因分型；PCR产物的克隆；制备含有单链突出末端的PCR产物或cDNA。

来源：

大肠杆菌重组、表达和纯化而获得。

酶储存溶液：

10mM Tris-HCl (pH 7.4), 50mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1mg/ml BSA, 50% (v/v) glycerol。10X E. coli UDG Buffer：200mM Tris-HCl, 10mM EDTA, 10mM DTT, pH 8.0 at 25℃。

失活或抑制：

95℃加热10分钟可以使95% E. coli UDG失活。由于经95℃加热10分钟处理后，其仍保持部分活性，建议加入UDG抑制剂(如来自枯草芽孢杆菌噬菌体PBS2的Ugi蛋白或噬菌体phi29的p56蛋白)进一步抑制其酶活以免其继续降解含有dU的PCR产物。

注意事项：

E. coli UDG酶在大多数PCR反应缓冲液体系中均有活性，但对于自行使用的PCR或RT-PCR体系，首次使用时建议先测试一下是否和所使用的体系兼容。通常取含dUTP的PCR扩增产物，参考图1加入适量UDG，观察能否有效降解含dUTP的PCR扩增产物。dNTP/dUTP推荐选购阿拉丁的D7376 dNTP/dUTP Mixture (2.5mM each/5mM)。由E. coli UDG酶消化产生的DNA链的无碱基位点可通过加热，碱处理或核酸内切核酸酶处理而除去。通常PCR反应过程中的加热步骤可以确保UDG酶消化的位点被完全剪切开。E. coli UDG酶在比较宽泛的pH范围内具有活性，其最适pH值为8.0，E. coli UDG酶活不需要二价阳离子，并被高离子强度(＞ 200 mM)所抑制。E. coli UDG酶可以在PCR反应前清除不慎污染的含dUTP的PCR产物，从而避免由于污染导致的PCR假阳性结果。E. coli UDG在加热变性后可能由于重折叠而在较低温度下表现出残留活性。因此，建议在退火步骤中使用55℃或更高的温度进行后续PCR。E. coli UDG可以用于DNA或cDNA的常规PCR或qPCR扩增体系，但通常不建议用于RT-PCR体系。因为在反转录条件下，通常E. coli UDG会保持活性，并可能消化新合成的cDNA。E. coli UDG酶经95℃加热10min处理后，仍会保持少量活性，如果希望用于RT-PCR体系，需要反转录和PCR分开进行，在反转录时不使用dUTP，在反转录后加入E. coli UDG酶处理，然后进行常规的PCR或qPCR，或者建议加入UDG抑制剂(如来自枯草芽孢杆菌噬菌体PBS2的Ugi蛋白或噬菌体phi29的p56蛋白)进一步抑制E. coli UDG的酶活性。本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明：

1.参考下表设置PCR反应体系，或者参考所使用的PCR扩增体系设置PCR体系，并加入E. coli UDG酶至终浓度为0.01U/μl。通常仅加入PCR buffer即可，无需加入UDG的buffer。 Reagent Volume Volume Final Concentration Nuclease-Free Water (18.325-x)μl (36.65-y)μl - 10X PCR Buffer (with Mg2+) 2.5μl 5μl 1X(1.5mMMg2+) dNTP/dUTP (2.5mMeach/5mM) 2μl 4μl 0.2mMeach/0.4mM Primer mix (10μM each) 2μl 4μl 0.8μM Template xμl yμl 10pg-1μg Taq DNA Polymerase (5U/μl) 0.125μl 0.25μl - E. coliUDG (5U/µl) 0.05μl 0.1μl - Total volume 25μl 50μl - 注1：根据实验需要，dNTP/dUTP (可购买阿拉丁D7376 dNTP/dUTP Mixture (2.5mM each/5mM))的终浓度可在0.2-0.6mM之间调整。镁离子的最终终浓度可在1.0-4.0mM之间调整。注2：对于25μl的PCR反应体系，E. coli UDG (5U/µl)的使用量一般为0.25-0.5U。注3：模板和引物的用量请参考阿拉丁Taq DNA Polymerase 使用说明或相应的PCR体系的产品说明书。2.参考上述反应体系，加入E. coli UDG后混匀，37℃孵育10min (本步骤可以有效去除可能的之前含dUTP的PCR扩增产物的污染)，后续就可以立即进入PCR扩增程序(须确保退火温度不低于55℃)。根据我们的实际测试结果发现，在退火温度不低于55℃的情况下，使用本产品的情况下不会影响PCR扩增的产物量。

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