T4 DNA 连接酶形成磷酸二酯键，以催化双链 DNA 中相邻的 5’-磷酸基和 3’-羟基末端连接。这种酶用于在过夜反应中连接黏性末端。这种酶可高效连接平末端和黏性末端，并修复双螺旋 DNA、RNA 或 DNA/RNA 杂交体中的单链切口。