黄曲霉毒素M1检测试剂
RIDASCREEN? Aflatoxin M1
简介
RIDASCREEN?  Aflatoxin M1  30/15产品编号: （R1111）

采用竞争酶标免疫法定量检测牛奶、奶粉和奶酪中的黄曲霉毒素M1。
试剂盒中包括了所有检测用的试剂。该试剂盒有96个试验孔（包括标准试验）
如果进行定量分析，必须有微孔板酶标仪。
（中文翻译件仅供参考，以试剂盒内附的英文原件为准）
样品制备
牛奶：脱脂
奶粉：还原、脱脂
奶酪：提取、离心
时间要求：（以10个样品为例）
牛奶/奶粉………………………….…….…….…大约0.5小时
奶酪………………………………….….………….大约2小时
孵育时间时间……………………….….………….大约1小时
检测下限
牛奶/奶粉：5ppt
奶酪：50ppt
回收率
牛奶：大约95％
奶粉：大约95％
奶酪：大约102％
交叉反应
黄曲霉毒素M1………………………………………….100％
黄曲霉毒素M2…..……………………………………….30％

1. 产品用途
RIDASCREEN? Aflatoxin M1 30/15试剂盒利用竞争性酶免疫分析方法，用于定量检测牛奶、奶粉和奶酪中的黄曲霉毒素M1。

2. 概述
黄曲霉毒素是Aspergillus flavus 和 Aspergillus parasiticus等霉菌的代谢产物，能致癌，高毒。
黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1的代谢产物。经摄入含有黄曲霉毒素B1饲料的奶牛产出的牛奶中，其中便含有黄曲霉毒素M1。由于黄曲霉毒素M1相当稳定，巴氏灭菌法也无法将其杀灭，所以检测黄曲霉毒素M1不仅要在饲料原料中检测，而且在最终产品中也需要进行鉴定。自1999年一月开始，欧盟就制定了黄曲霉毒素残留的检测限，黄曲霉毒素M1的检测限为0.05 μg/l （50 ppt）。
使用RIDASCREEN?  Aflatoxin M1 30/15可以精确定量检测牛奶、奶粉和奶酪中的黄曲霉毒素M1。

3. 测定原理
测定的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有针对黄曲霉毒素M1的特异性抗体。加入标准或样品溶液和在洗板后加入黄曲霉毒素酶标记物，游离黄曲霉毒素M1与黄曲霉毒素M1酶标记物竞争结合黄曲霉毒素M1抗体的结合位点（竞争性酶免疫分析方法）。没有连接的酶标记物在洗涤步骤中被除去。加入底物/发色剂到孔中并且孵育。结合的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的产物。加入反应停止液后使颜色产生由蓝色变成黄色。在450nm处测量，吸光值与样品中黄曲霉毒素M1浓度成反比。

4． 提供的试剂
每一个盒中的试剂足够进行96个测量（包括标准测定孔）
盒中的材料如下：
1×96孔板（12条 X  8孔）包被有黄曲霉毒素M1抗体
6×黄曲霉毒素M1标准液，1.3 ml/瓶
浓度为：0 ppt， 5 ppt，10 ppt，20 ppt，40 ppt，80 ppt
黄曲霉毒素M1的牛奶缓冲液
1×酶标记物（1.3ml）……………………………….红色帽
过氧化物酶标记物的黄曲霉毒素M1
1×底物/发色剂（12ml）…………………………….. 蓝色帽
微红色，包含四甲基苯醌
1×反应停止液（14ml）...….…………………... ……黄色帽
为1N硫酸
1×缓冲液1（20ml）
样品稀释缓冲液
1×缓冲液2（12ml）...….…………………... …….…白色帽
酶标记物稀释缓冲液
1×洗涤缓冲液
为10Mm的磷酸缓冲液（pH7.4），包含0.05%的Tween20
5. 需要的材料但盒中不提供
5.1设备
－－－－微孔板酶标仪（450nm）
－－－－离心机
－－－－巴氏吸液管
－－－－刻度吸量管
－－－－50ul，100ul，400ul微量加样器

－－－－只用于奶酪检测
－－－－振荡器
－－－－蒸发器
5.2 试剂
－－－－甲醇
－－－－n-庚烷
－－－－二氯甲烷
－－－－PBS-缓冲液，pH 7.2：
0.55g  NaH2PO4 x H2O+ 2.85g Na2HPO4 x 2H2O +9gNaCl , 加入蒸馏水至1000ml

6.  操作者应该注意之事项
－－－－标准液含有黄曲霉毒素M1（致癌），要特别小心，应戴手套，避免试剂接触皮肤
－－－－使用过的玻璃容器最好用pH7的次氯酸溶液（10%V/V）浸泡过夜
－－－－反应停止液为1N硫酸，避免接触皮肤
－－－－不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度的降低
－－－－不要交换使用不同批号的盒中试剂

7.   储存条件
－－－－保存试剂盒于2-80C。不要冷冻
－－－－将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封
－－－－标准物质对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下
－－－－无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下

8．  试剂变质的迹象
发色试剂若显色表明发色剂变质，应当弃之。
0标准的吸光度值小于0.6个单位 （A450nm<0.6）时，表示试剂可能变质。

9． 样品处理
9.1. 牛奶
－－－－取牛奶样品，用冷冻离心机（3500g ，10℃）离心10分钟去除脂肪
（如没有冷冻离心机，可将样品先冷却到10℃，再离心）
－－－－离心后用巴氏吸液管彻底去除上层奶油。
－－－－取脱脂牛奶用于检测（每孔100μl）
9.2. 奶粉
－－－－用天平称取10g奶粉到容量瓶加去离子水到100ml。
（还原牛奶）
－－－－震荡5分钟，使充分溶解。
－－－－按照9.1牛奶样品处理步骤进行

9.3. 奶酪
代表性的样品应该研磨，充分混合。整个均质过程不要加入任何液体。
如果奶酪表面呈现出不同状态，则不要取奶酪表面作为样品，否则将影响检测结果。
－－－－称取2 g研磨过的奶酪，装入玻璃离心管中。
－－－－加入40ml二氯甲烷，放在振荡器上震荡15分钟。
－－－－过滤后取10ml滤液60 °C氮气吹干
－－－－将吹干残留的油状物用0.5 ml甲醇、0.5 ml PBS缓冲液（参见5.2.）和1 ml庚烷充分混合溶解。
－－－－离心: 15分钟 / 2700 g / 15 °C 
－－－－完全除去上层庚烷层。
－－－－用巴氏移液管小心移取部分甲醇水层
－－－－取100 μl甲醇水层用400 μl缓冲液1稀释成为含10%甲醇的溶液
－－－－每孔用100 μl进行检测。 
备注:如果需要进一步稀释溶液，则使用缓冲液1进行稀释。

10.  酶标免疫分析程序
10.1测定之前注意事项
1. 用之前将所有试剂回升至室温（20-25℃）。
2. 使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。 
3. 在使用中不要让微孔干燥。
4. 在EIA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，仔细按照推荐的洗板顺序操作是EIA测定程序中的要点。
5. 在所有孵育过程中，避免光线照射，用盖子盖住微孔板。

10.2 黄曲霉毒素M1酶标记物
Aflatoxin M1 酶标记物（红帽）为浓缩液。由于稀释了的酶标记物稳定性不好，因此只稀释需用量的酶标记物。稀释前酶标记物应轻轻振荡混匀。酶标记物用缓冲液2（白帽）以1: 11的比例稀释（400 μl浓缩液+ 4.0 ml 缓冲液，足够4个微孔板条32孔检测）

10.3 洗涤缓冲液
在试剂盒中提供一包洗涤缓冲液的粉剂，一包粉剂溶解于1升的蒸馏水中，制备好的洗涤缓冲液在4oC条件下可以保存4周。

10.4 包被有抗体的微孔板条
锡箔袋沿横向边压封线外侧剪开。取出需用数量的微孔板及框架，将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于2-80C。不要冷冻。

10.5  测定程序  （在20-25 oC条件下操作）
1．将足够标准和样品所用数量的孔条插入微孔架，标准及样品做平行，并记录标准及样品的位置。
2.  加入100ul的标准或处理好的样品到各自的微孔中，轻轻震板混合，在室温（20-25 oC）暗处孵育30分钟。
3．倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中液体。每孔注入250ul洗涤缓冲液（见10.3）再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，重复操作洗涤步骤两次以上。
4．加入100ul酶标记物（红色帽）到微孔底部，轻轻震板混合，在室温（20-25 oC）暗处孵育15分钟。
5．倒出孔中的液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中液体。每孔注入250ul洗涤缓冲液（见10.3）再次倒出孔中的液体，完全除去孔中的液体，重复操作洗涤步骤两次以上。
6．加入100ul底物/发色剂到微孔中，混合后在室温（20-25 oC）暗处孵育15分钟。
7．加入100ul反应停止液到微孔中，混合好在450nm处测量吸光度值，以空气为空白，15分钟内读取光度值。

11.  结果
所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准 （0标准） 的吸光度值再乘以100。因此0标准等于100%并且以百分比给出吸光度值。
标准的吸光度值（或样品）
────────────── × 100= %吸光度值
0标准的吸光度值
计算的标准值绘成为一个以黄曲霉毒素M1浓度（ng/l）的半对数坐标系统曲线图，校正曲线在10-40 ng/l （ppt）范围内应当成为线性，相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。
为了得到样品中黄曲霉毒素M1的含量（ng/l），在标准曲线上读取的浓度必须乘以相应的稀释倍数。样品的稀释倍数如下：
牛奶/奶粉........................…………………….................1
奶酪....................................................……………….... 10

R-Biopharm开发出用于计算ELISA试剂盒检测结果的专用软件RIDA? SOFT，可以向当地分销商索取该软件。

12．  灵敏度
RIDASCREEN?  Aflatoxin M1 30/15试剂盒的最低检测下限为大约5 ppt，按照样品处理记录，牛奶、奶粉的检测限为5 ppt，奶酪的检测限为5 0ppt。


13． 特异性
RIDASCREEN?黄曲霉毒素M1 30/15试剂盒的特异性通过对相应的霉菌毒素交叉反应性分析而得到：
交叉反应：黄曲霉毒素M1....................................... 100 %
黄曲霉毒素M2.........……......................... 30 %

14．  再现性
由三个不同的实验结果确定了室内精密度，图2显示出RIDASCREEN?  Aflatoxin M1 30/15试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应黄曲霉毒素M1浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

15.  回收率
牛奶的回收率大约 95 % ，平均变异系数约14 %。
奶酪的回收率大约为102 % ，平均变异系数大约为11 %。