PfuDNAPolymerase
| 品牌 | 厂商性质 | 产地 | 货期 |
|---|---|---|---|
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概述
本酶是一种高保真的耐热性DNA聚合酶，其保真度是Taq DNA聚合酶的8~10倍。该酶不仅具有5′-3′DNA聚合酶活性，还具有3′-5′核酸外切酶校对活性，能及时切除DNA合成链中碱基错配的核苷酸，大大增加了碱基配对的正确率，保证了DNA合成的高度忠实性。该酶不具有5′-3′核酸外切酶活性。
应用
1.高保真PCR (high fidelity PCR)、点突变、双平端PCR克隆。
2.该酶扩增出来的DN**断为双平端，可用于双平端克隆，不能用于常规T载体克隆。
3.dUTP和dITP或含有dUTP和dITP的引物不能用于该酶介导的PCR扩增反应。
来源
含有来自Pyrococcus furiosus.的Pfu DNA polymeras基因的E.coli。
活性单位定义
以小牛胸腺DNA为模板，在72℃反应30min，能催化10nmol的dNTP聚合为多核苷酸片段的酶量定义为1个活性单位（U）。
贮存条件
20 mMTris-HCl (PH8.0)，100 mMKCl，0.1 mMEDTA，0.1 % NP-40 (v/v)，0.1 % Tween-20 (v/v)，1 mMDTT，50 %甘油（v/v），-20°C贮存。
10×Pfu Buffer（with Mg2+）
200 mMTris-HCl (PH 8.8)
20 mMMgSO4
100 mMKCl
100 mM(NH4) 2SO4
1% Triton X-100
1 mg/ml nuclease-free BSA
常规PCR反应条件
一.室温融化反应所需溶液后涡旋混匀并短暂离心至管底，连同PfuDNA聚合酶置于冰上。
二.按下表依次加入如下组分
| ddH2O（nuclease-free） | 变量 |
| 10×Pfu Buffer（With Mg2+） | 5µl |
| dNTP Mix（10mMeach） | 1µl |
| Forward primer | 0.1~1.0µM |
| Reverse primer | 0.1~1.0µM |
| Template DNA | 50pg~1µg |
| Pfu DNA polymerase | 1.25U~2.5U |
| 总体积 | 50µl |
| ddH2O（nuclease-free） | 变量 |
| 10×Pfu Buffer（With Mg2+） | 5µl |
| dNTP Mix（10mMeach） | 1µl |
| Forward primer | 0.1~1.0µM |
| Reverse primer | 0.1~1.0µM |
| Template DNA | 50pg~1µg |
| Pfu DNA polymerase | 1.25U~2.5U |
| 总体积 | 50µl |
| 人类基因组DNA | 50~500ng |
| 大肠杆菌基因组DNA | 5~50ng |
| λDNA | 0.5~10ng |
| 质粒DNA | 0.1~5ng |
② 可以使用不含Mg2+的反应Buffer,并根据需要自行添加MgSO4达到Mg2+的最适反应浓度。
三.轻轻振荡混匀反应液并短暂离心，如果PCR仪没有热盖可加入一半体积的矿物油。
四.将PCR管放入PCR仪中，设置并运行PCR反应条件可参考下表：
| 步骤 | 温度 | 时间 | 循环次数 |
| 预变性 | 94℃ | 3~5min | 1 |
| 变性 | 94℃ | 30s | 25~35 |
| 退火 | Tm-5℃ | 30s | |
| 延伸 | 72℃ | 2min/kb | |
| 最后延伸 | 72℃ | 5~15min | 1 |
注：PCR反应条件视模板、引物等结构条件不同而各异，在具体操作中需要根据模板类型、目的片段大小、扩增片段的碱基序列和引物的GC含量及长短等具体情况来设计最佳的反应条件，包括退火温度，延伸时间等。
质量控制
Forward primer：5-GGAAGAAGCTTGCTTCTTTGCTGAC-3
Reverse primer：5-AGCCCGGGGATTTCACATCTGACTTA-3
PCR程序：94°C, 3 min; 35 cycles( 94°C, 30 sec; 55°C, 30 sec; 72°C, 45 sec); 72°C, 7 min
0.8%琼脂糖电泳检测没有544bp产物出现，表明通过该项检测。
质粒污染检测：
T7 Promoter Primer：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3
T7 terminator Primer：5’-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3
PCR程序：94°C, 3 min; 35 cycles( 94°C, 30 sec; 55°C, 30 sec; 72°C, 45 sec); 72°C, 7 min
0.8%琼脂糖电泳检测没有PCR产物条带出现，表明通过该项检测。
支原体污染检测：
PCR产物：717 bp
GPO-1 ：5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA-3
MGSO ：5’-TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC-3
PCR程序：94°C, 3 min; 35 cycles( 94°C, 30 sec; 55°C, 30 sec; 72°C, 45 sec); 72°C, 7 min
0.8%琼脂糖电泳检测没有PCR产物条带出现，表明通过该项检测。
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