钙⻩绿素-AM (Calcein-AM) 和碘化丙啶(PI) 溶液，分别对活细胞和死细胞染色，可用于同时对活细胞和死细胞进行荧光染色。Calcein-AM的乙酸甲基酯亲脂性很高，使其可透过细胞膜。尽管Calcein-AM本身并不是荧光分子，但通过活细胞内的酯酶作用，Calcein-AM能脱去AM基，产生的Calcein能发出强绿色荧光 (激发: 490 nm，发射: 515 nm)。因此Calcein-AM仅对活细胞染色。另一方面，作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜。它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光 (激发: 535 nm，发射: 617 nm)。由于Calcein和PI-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545 nm激发，仅可观察到死细胞。由于不同细胞系的最佳染色条件不同，我们建议个别确定Calcein-AM和PI的合适浓度。
I.试剂

Calcein-AM 4mM 50uL in DMSO; Unit Size #500 assays·PI (2mM) 150uL in water
II.操作说明
用荧光显微镜观察细胞形态，以HeLa细胞染色为例，请注意不同的细胞种类、不同浓度，有不同的观察条件。根据细胞条件，摸索不同条件下的细胞贴壁情况和试剂浓度的配制等最佳条件。
1.染色溶液的配制
1) 将Calcein-AM储备液和PI储备液平衡到室温。
2)分别加 2.5 μl Calcein-AM原液和 12.5μl PI原液至5 mL PBS（pH=7.4）中配制成染色工作液。染色工作液中 Calcein-AM的浓度为2 μmol/L，PI的浓度约为 5 μmol/L。
2.细胞染色
1)染色HeLa细胞等贴壁细胞时，先用Trypsin-EDTA等消化细胞，制备成细胞悬液。
2)将细胞悬液离心3分钟(1,000 rpm)。
3)去除上清液，加入PBS缓冲液，细胞数量调整至105-106个/ml。再用移液器充分混匀。
4)由于培养基中的血清等含有酯酶，Calcein-AM遇水会分解，会导致空白上升，所以需要离心数次，用PBS洗涤数次直到完全洗净。
5)将200 μl细胞悬液移至小试管中，加入100 μl染色工作液，在37°C下孵育15分钟。6)在盖玻片上滴加适量的染色的细胞溶液。7)在荧光显微镜下，先用490±10 nm波⻓激发，观察⻩绿色的活细胞，还可以同时观察到红色的死细胞，然后用545 nm波⻓激发，能够看到红色的死细胞。
3.染色试剂的最佳浓度
Calcein-AM和PI最佳浓度根据细胞种类而定，通过以下的操作，可找到不同细胞染色试剂的最佳浓度。
1)通过在0.1%皂苷或0.1-0.5%毛地黄皂苷中孵育10分钟或通过在70%乙醇中孵育30分钟制备死细胞。
2)用0.1-10 μM PI溶液对死细胞染色，以便找到仅对细胞核染色而不对细胞质染色的PI浓度。
3)用0.1-10 μM Calcein-AM溶液对死细胞染色，以便找到不对细胞质染色的Calcein-AM浓度。接着用该浓度的Calcein-AM对活细胞染色以检验活细胞可否被染色。
III.注意事项
1) Calcein-AM的ester部位遇到湿气会分解，使用后请在-20度下密闭冷冻保存，防止水分进入。Calcein-AM储备液用缓冲液或培养基等稀释时尽量现配现用。
2)使用时一定要带手套、眼罩、口罩。万一接触到皮肤的话，迅速使用大量水清洗。