早在30多年前，VicalIncorporated公司首次使用mRNA进行药物开发，将mRNA通过脂质体递送至体内，并发现其可在体内完成翻译。该研究为mRNA在生物医药领域的应用奠定了理论基础。2020年新冠疫情的爆发，mRNA疫苗开启了疫苗的新纪元，国内外各大药企争相涌入mRNA技术赛道。

mRNA疫苗的工作原理是将病毒的部分mRNA片段，以特殊的脂质膜包裹，注入人体细胞内产生抗原，再由此激发特异性免疫反应，达到形成免疫记忆的效果。

mRNA疫苗的特点

• mRNA不进入细胞核，不会整合到人基因组上，安全性较高；

• 可激活体液免疫和细胞免疫双重免疫系统，有效性更强，保护率更高；

• 研发周期短，尤其是在应对病毒变异时，只需对S蛋白序列的碱基进行突变，就能够快速开发新型候选疫苗；

• 不需要细胞培养等过程，生产效率更高。

mRNA疫苗的开发包括mRNA体外合成、载体递送等过程。其中，mRNA体外合成所需的原料酶对于 mRNA疫苗的产业化生产至关重要。多宁生物提供全系列的GMP&非GMP原料酶，助力mRNA疫苗的产业化生产。

线性模板制备 

工业生产中，mRNA体外转录的模板通常是质粒，在体外转录前需要对质粒进行线性化处理，因为转录反应会延续至DNA模板的末端，环状质粒模板会转录生成大小不同的mRNA转录本，线性化可以确保获得确定长度及序列的mRNA转录本。

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Bsal 

线性化模板可通过限制性内切酶酶切质粒获得，需确保酶切产物为平末端或5’端突出结构。需使用IIS型限制性内切酶，IIS型限制性内切酶的酶切位点在识别位点以外，酶切完5’端突出。BsaI是一种IIS型限制性内切酶，它的识别位点为6个碱基组成，具有高度特异性而极不容易出现‘类’酶切位点，能够有效避免出现非特异性的酶切。

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mRNA体外转录 

体外转录（IVT）是以线性化质粒为模板，在RNA转录酶、NTP等条件下，模仿体内转录过程生成mRNA的技术。质粒模板通常使用的启动子为T7启动子，其转录强度较高，是目前原核表达应用最广泛的启动子。T7 RNA Polymerase（T7 RNA聚合酶）对T7启动子具有高度特异性，且其活性较高，在Inorganic Pyrophosphatase、Murine RNase Inhibitor、DNaseI的辅助下，合成高产量的mRNA。

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T7 RNA聚合酶 

本品为重组E.coli 表达的T7噬菌体DNA编码的蛋白，是一种高度特异性识别T7启动子序列（5’-TAATACGACT CACTATAGGG-3’）的 DNA依赖的5'→3' RNA聚合酶。以含有T7启动子序列的单链或双链DNA为模板，NTP为底物，合成与启动子下游的单链DNA或双链DNA模板链互补的RNA。

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无机焦磷酸酶 

本品是重组大肠杆菌表达酵母来源的无机焦磷酸酶（PPase），是一种催化一分子焦磷酸盐转化为两分子磷酸盐离子的酶，使无机焦磷酸盐水解生成正磷酸盐，这是一个高放能的反应，因此，此反应可偶联到一些热力学上不利的转化，以便驱动这些转化进行完全。在分子生物学中可用于体外转录反应中提高mRNA产量。

无机焦磷酸酶作用原理

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鼠源RNase抑制剂

本品是以可溶形式在大肠杆菌中表达纯化的鼠源RNase抑制剂，能抑制 RNase A, RNase B 或 RNase C 这三种酶的活性，主要参与mRNA体外转录中对mRNA的保护。

DNaseI(脱氧核糖核酸酶I)

DNase I是一种可消化单链或双链DNA的脱氧核糖核酸内切酶，它识别并切割磷酸二酯键，产生5'-磷酸基团和 3'-OH的单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸。

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mRNA加帽系统 

体外转录的mRNA的5’端含有三磷酸基团，具有很强的免疫原性，若将其递送至体内，会激活固有免疫应答，RIG-1会识别三磷酸基团，导致其无法在体内正确翻译出抗原蛋白。因此，在工业生产中需对 mRNA进行加帽修饰以逃避固有免疫系统。使用酶法进行加帽，首先应使用牛痘加帽酶使mRNA的5'端带上帽0帽子，再进一步使用mRNA 帽 2'-O-甲基转移酶 (GMP 级)，使帽0转变为帽1。帽1的免疫原性比帽0低，不易被RNA 传感器识别。

mRNA酶法加帽

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