1、原理及适用范围

        菌落总数是指样品经过处理，在一定条件下培养后所得1mL(g)检样或单位面积样品中所含菌落的总数，是最常用的微生物检测项目。菌落总数测试片（Filmplate^TM Aerobic BB202）是一种预先制备好的一次性培养基产品，含有标准的营养培养基，冷水可溶性的吸水凝胶和脱氢酶指示剂氯化三苯基四氮唑（TTC），菌落在测试片上呈红色，这样可缩短计数时间和增强计数效果。本产品适合于各类食品及食品原料中菌落总数的测定，也可用于检测食品加工容器、操作台和其他设备表面的菌落总数。执行标准：食品安全国家标准 食品微生物学检验菌落总数测定（GB/T 4789.2-2010）。



2、操作方法

        2.1、样品处理：取样品25mL（g）放入含有225mL灭菌磷酸缓冲液稀释液（或生理盐水）的取样罐或均质杯内，制成1:10的样品匀液，必要时用1mol/LNaOH或1mol/L HCl溶液调节样品匀液pH至6.6～7.2。用1mL灭菌吸管吸取1:10样品匀液1mL，注入含有9mL稀释液的试管内，振摇后成为1:100的样品匀液，以此类推，做出1:1000等稀释度的样品匀液，每次换一支吸管。

        2.2、接种：一般食品选2～3个稀释度进行检测，含菌量少的液体样品（如饮用纯水和矿泉水等）可直接吸取原液进行检测。将菌落总数测试片（BB202）置于平坦实验台面，揭开上层膜，用无菌吸管吸取1mL样品匀液慢慢均匀地滴加到纸片上，然后再将上层膜缓慢盖下，静置10s左右使培养基凝固，每个稀释度接种两片。同时做一片空白阴性对照。

        2.3、培养：将测试片叠在一起放回原自封袋中并封口，透明面朝上水平置于恒温培养箱内，堆叠片数不超过12片。一般食品培养温度为36℃±1℃，培养15～24h；水产品培养温度为30℃±1℃，培养48h。



3、结果判读

        细菌在测试片上生长后会显示红色斑点，选择菌落数适中（30～300个）的测试片进行计数，乘以稀释倍数后即为每毫升（或每克）样品中所含的细菌菌落总数。

                                                                                           

4、计数原则及报告方式

       4.1、若只有一个稀释度纸片上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个纸片菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每毫升(或克)样品中菌落总数结果。

       4.2、若有两个连续稀释度的纸片菌落数在适宜计数范围内时，按式(1)计算: 

                                                                                                                  

       式中：

       N——样品中菌落数；

       ∑C——测试片上(含适宜范围菌落数的测试片)菌落数之和；

       n₁——第一个适宜稀释度测试片数；

       n₂——第二个适宜稀释度测试片数；

         d——稀释因子(第一稀释度)。

       示例：

                                                       



                                                                                           上述数据经“四舍五入”后，表示25000或2.5×10⁴。

        4.3、若所有的稀释度菌落总数均大于300CFU，则对稀释度最高的测试片进行计数，其他测试片可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

        4.4、若所有的稀释度菌落总数均小于30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

        4.5、若所有的稀释度（包括液体样品原液）均无菌落生长，则以小于1乘以最低稀释倍数计算。

        4.6、若所有稀释度的平均菌落数均不在30CFU～300CFU之间，其中一部分小于30CFU或大于300CFU，则以最接近30CFU或300CFU的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

        4.7、菌落总数的报告

           4.7.1、菌落总数在100CFU以内时，按“四舍五入”原则修约，采用两位有效数字报告。

           4.7.2、大于或等于100CFU时，第三位数字采用“四舍五入”原则修约后，取前两位数字，后面的0代替位数，也可用10的指数形式来表示，按“四舍五入”原则修约后，采用两位有效数字。

           4.7.3、若测试片上一片红色无法计数时，则报告多不可计。

           4.7.4、若空白对照上有菌落生长，则此次检测结果无效。

           4.7.5、称重取样以CFU/g为单位报告，体积取样以CFU/mL为单位报告。



5、表面取样方法

        加1mL灭菌磷酸缓冲液（或生理盐水）在测试片上，至少静置10S，使培养基凝固；提起上层膜，使中央滤纸部分贴到待测物表面，用手在外侧轻压；然后将上盖膜合上，置培养箱内培养。



6、附加说明

         6.1、菌落总数测试片检测结果与传统平板计数琼脂平板法符合率可达80％以上，山东省疾病预防控制中心进行的验证试验表明，24h计数测试片上菌落数为平板菌落数的87％。

         6.2、磷酸缓冲液稀释液的配制与灭菌：贮存液：称取34.0g的磷酸二氢钾溶于500mL蒸馏水中，用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2，用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15分钟，或者放入消毒碗柜中消毒。

         6.3、生理盐水的配制与灭菌：取8.5g分析纯氯化钠（NaCl）溶解到1000mL蒸馏水或纯净水中，先煮开后进行分装，取9mL加入到10mL洁净试管中，盖上硅橡胶塞或棉纱塞，放入红外线消毒柜中消毒。



7、保存条件

        本产品需存放在4℃～10℃冰箱中，保质期为一年，铝箔袋打开后,未用完的纸片要放回铝箔袋中封好，放到冰箱中，一个月内用完。在高湿度的环境中可能出现冷凝水，最好在拆封前将整包回温至室温。