疏水层析（HIC）的分离是基于蛋白质的疏水性氨基酸与基质的疏水性配基之间的可逆性相互作用。

蛋白质和多肽的疏水氨基酸大多埋藏在蛋白质分子结构的内部。然而，仍然有一些疏水性氨基酸会暴露在蛋白分子的表面与基质的疏水性配基进行相互作用。与反相层析相比，疏水作用层析基质上的配体浓度要低很多，洗脱条件也更加温和，从而有助于保持生物分子的生物活性。HIC特别适合于纯化经过硫酸铵沉淀或高盐洗脱后的样品，高离子强度可以加强蛋白与填料配基之间的疏水相互作用。

高离子强度的缓冲液可以增强疏水相互作用，这使得HIC成为硫酸铵沉淀和离子交换层析的一个卓越的纯化步骤。HIC非常适合于纯化工艺中的捕获或中纯步骤。

HIC期间，样品成分在高离子强度的缓冲液（典型的是1~2M的硫酸铵或者是3M的NaCl）中结合到填充柱上。高浓度的盐，尤其是硫酸铵，可能会沉淀蛋白质。因此，需要检测将要使用的结合条件下靶蛋白的溶解性。通常采用降低的盐梯度对靶蛋白进行连续梯度或分布梯度洗脱。